瑞舒伐他汀對擴張型心肌病大鼠心肌組織賴氨酰氧化酶表達水平的影響

劉會 楊龍△ 榮季冬 蔣智 王紀人

(1.貴州省人民醫院心內科，貴州 貴陽 550002； 2.遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州 遵義 563003)

·論 著·

瑞舒伐他汀對擴張型心肌病大鼠心肌組織賴氨酰氧化酶表達水平的影響

劉會1楊龍1△榮季冬2蔣智1王紀人1

(1.貴州省人民醫院心內科，貴州 貴陽 550002； 2.遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州 遵義 563003)

目的 探討瑞舒伐他汀對擴張型心肌病大鼠心肌組織賴氨酰氧化酶(LOX)表達的影響。方法 成年大鼠50只，隨機分為三組：對照組(NS組：n=10只，腹腔注射等量生理鹽水)；擴張型心肌病模型組(DCM組：n=20，腹腔注射阿霉素)；干預組(GY組：n=20，腹腔注射阿霉素，同時給予瑞舒伐他汀灌胃)。10周末處死大鼠，HE、Masson染色測定心肌組織膠原纖維化情況；提取左室心肌組織RNA及蛋白質，RT-PCR法及Western blot測定心肌組織LOX的mRNA及蛋白表達水平。結果 HE、Masson染色顯示DCM組大鼠心肌組織明顯纖維化，而GY組大鼠心肌組織纖維化程度較輕；DCM組大鼠心肌組織LOX的mRNA及蛋白表達水平明顯高于NS組(P<0.01)；與DCM組相比， GY組心肌組織LOX的mRNA及蛋白的表達明顯下調(P<0.01)。結論 瑞舒伐他汀可逆轉DCM大鼠心肌組織纖維化及LOX的表達。

擴張型心肌病； 蛋白賴氨酰氧化酶； 瑞舒伐他汀

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一種病因未明的心肌疾病，好發于青壯年，預后極差，嚴重影響患者的生存質量；其主要病理特征是心肌細胞變性、壞死，心肌間質中膠原纖維大量增生、排列紊亂，導致心肌組織重塑及心功能不全。賴氨酰氧化酶(lysyl axidase,LOX)在膠原纖維和彈性纖維的活化和表達中具有重要的作用，參與很多心血管疾病的發生發生發展[1]。在心肌梗死后心室重塑過程中，心肌纖維化程度越重，LOX表達水平越高。目前的研究多涉及LOX在心肌組織重塑中的表達變化情況，而關于藥物干預后LOX表達變化國內外相關報道較少。本實驗旨在觀測瑞舒伐他汀對DCM大鼠心肌組織膠原纖維及LOX表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組

8周齡、SPF級雄性SD大鼠50只[合格證號：SCXK(渝)2012-0005]置于室溫22～25 ℃、相對濕度45%左右的動物房內飼養，顆粒飼料[合格證號：SCXK-(粵)2008-0002]喂養，均自由飲水。隨機分為三組：對照組(NS組：n=10)，腹腔注射等量生理鹽水；擴張型心肌病模型組(DCM組：n=20)，腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，1次/周，共6周，累計劑量15 mg/kg；干預組(GY組：n=20)，腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，1次/周，共6周，累計劑量15 mg/kg，同時給予瑞舒伐他汀3 mg/kg·d-1灌胃。

1.2 心臟超聲檢測

10周末，10%水合氯醛(4 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，8% Na2S脫去大鼠胸部皮毛。采用VisualSonics Vevo770超聲心動圖儀17.5 MHz探頭(加拿大Visual Sonics公司)測量左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室收縮未期內徑(LVESd)、左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。

1.3 組織標本處理及HE、Masson染色

大鼠麻醉狀態下開胸取出心臟，去掉殘余的大血管及心外膜，去除右心室和右心房，保留室間隔，冷肝素鹽水洗凈心腔內殘余的血液。垂直心臟左心室長軸將心臟一分為二，心底部凍存于液氮中檢測RNA和蛋白質，心尖部用于HE染色。常規石蠟包埋后制成5 μm厚的切片，行HE、Masson染色。采用Nikon Eclipse 80i 顯微鏡對所得切片進行觀察并采集圖像。

1.4 RT-PCR法檢測

提取凍存心肌組織總RNA，計算總RNA的濃度和純度。取1 μg總RNA按逆轉錄試劑盒說明書方法合成cDNA，產物按PCR試劑盒說明書方法進行PCR反應。所有引物均參造Genebank提供的序列，由大連晨鈺生物有限公司合成。β肌動蛋白(β-actin)上游引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，擴增片段為150bp；LOX上游引物:5’-ATGCCAGCACACAGAGGAGAG-3’，下游引物：5’-AGGCGTGATGTCCTGTGTAGC-3’，擴增片段為300 bp，反應體系為25 μL， 95℃變性25 s，52℃ 退火35 s，72 ℃ 延伸65 s，共循環42次。PCR產物以3%瓊脂糖凝膠電泳，以Bio-Image Analysis System分析各條帶的光密度值，計算目的條帶與內參(β-actin)的比值，以此作為目的基因的相對表達量。

1.5 Western Blot法檢測

提取大鼠心肌組織全蛋白，測定蛋白濃度。取50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白及轉膜，15%脫脂牛奶-PBST溶液室溫下封閉60 min，然后將膜與一級抗體(β-actin∶鼠抗單克隆抗體，1∶2 000；LOX∶羊抗人多克隆抗體，1∶500；)在4 ℃結合過夜，次日PBST洗膜10 min×5次，加入HRP標記的二級抗體(β-actin∶山羊抗小鼠，1∶20 000；LOX∶兔抗羊，1∶2 000；)室溫下結合60 min，PBST洗膜10 min×5次，ECL法發光顯像，X線壓片曝光，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統進行灰度分析，用目標蛋白的灰度值比β-actin的灰度值，所得數值代表目標蛋白的相對含量。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 心衰癥狀

經腹腔注射阿霉素后，DCM組及GY組大鼠逐漸出現心衰癥狀，活動量減少，進食量下降，并出現不同程度脫毛、紫紺及水腫。

2.2 各組大鼠超聲心動圖比較

與NS組比較，DCM組、GY組大鼠心臟普遍擴大，心臟室壁運動減弱，左心室收縮及舒張功能明顯下降，表現為LVEDd和LVESd明顯增加，LVEF及%FS明顯下降；與DCM組比較，GY組LVEDd和LVESd有所下降，LVEF及%FS有所回升(P<0.05)。見表 1。

表1 各組大鼠心臟超聲參數變化±s)

注：與NS組比較，aP<0.05，bP<0.05。

2.3 HE染色

與NS組比較，DCM組和GY組大鼠心肌細胞水腫，排列紊亂，細胞間隙增寬，可見心肌纖維斷裂；與DCM組相比，GY組心肌損害有所減輕。見圖1。

注：a.NS；b.DCM；c.GY圖1 各組大鼠心肌組織HE染色

2.4 Masson染色

與NS組比較，DCM組和GY組大鼠心肌組織均有明顯纖維化，而GY組心肌組織纖維化有所減輕。見圖2。

注：a.NS；b.DCM；c.GY圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色

2.5 各組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達水平的比較

與NS組比較，DCM組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與DCM組比較，GY組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達明顯下調(P<0.01)。見圖3、表2。

M.Maker；1：NS；2：DCM；3：GY 1：NS；2：DCM；3：GY 圖3 各組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達的比較

組別鼠(n)LOX(mRNA)LOX蛋白NS組100．54±0．030．56±0．03DCM組200．85±0．02a0．80±0．04aGY組200．66±0．02b0．67±0．02b

注：與NS組比較，aP<0.01；與DCM組比較，bP<0.01。

3 討 論

DCM是一種以全心擴大伴收縮功能障礙為典型特征的心肌病，病程呈進行性惡化，預后較差，病理特征是心肌細胞變性、壞死及心肌間質中膠原纖維大量增生。心肌組織重塑的過程貫穿DCM發病的始終。

LOX是膠原纖維和彈性纖維通過共價交聯取得穩定性和發育成熟的關鍵酶，具有穩定細胞外基質免受MMP降解的功能[2]。LOX表達過少，組織力學性能不足；但LOX表達過多，易致組織膠原沉積及纖維化[3]。過度的膠原沉積可引起心肌纖維化，降低心臟舒張功能，最終導致心力衰竭。此外，有研究[4]表明，心肌組織LOX表達上調與慢性心力衰竭左室順應性降低有關，LOX過度表達可促進膠原纖維增生，使心肌順應性降低，這可能是引起慢性心力衰竭者心臟重塑的一個重要原因。此外，提取心肌梗死患者死亡后的心臟組織發現， LOX表達明顯上調，且與細胞外基質成分改變及心肌纖維化形成有關[5]。既往我們的研究表明，慢性心力衰竭小鼠心肌組織LOX表達上調，阿托伐他汀可下調慢性心力衰竭小鼠心肌組織LOX，LOX可通過p38及NF-κB信號通路調節MMP-9的表達[6]。

本實驗結果表明，對照組大鼠心功能正常；DCM組大鼠心功能惡化，心肌組織膠原纖維、LOX mRNA和蛋白表達明顯上調；應用瑞舒伐他汀干預DCM大鼠后，心肌組織膠原纖維、LOX mRNA和蛋白表達下降。實驗提示瑞舒伐他汀可逆轉DCM大鼠心肌組織膠原纖維及LOX的表達，這可能是瑞舒伐他汀抑制心臟重塑的重要機制。LOX可能是調節心肌組織膠原纖維變化的重要的細胞因子。瑞舒伐他汀可否通過別的細胞因子影響膠原纖維的表達，本研究未涉及。

[1] Li W，Liu G, Chou IN, et a1. Hydrogen peroxide-mediated, lysyl oxidase-dependent chemotaxis of vascular smooth muscle cells[J]. J Cell Biol, 2000, 78(4): 550-557.

[2] Csiszar K. Lysyl Oxidase: a novel multifunctional amine oxidase family [J].Prog Nuclei Acid Res Mol Bio, 2001, 70: 1-32.

[3] Smith-Murgo Li, Kagan HM. Lysyl Oxidase: properties, regulation and multiple functions in biology [J]. Matrix Biol, 1998, 16(7): 387-398.

[4] Lopez B, Querejeta R, Gonzalez A, et al. Impact of treatment on myocardial lysyl oxidase expression and collagen cross-linking in patients with heart failure [J]. Hypertension， 2009, 53(2): 236-242.

[5] Xie Y, Chen J, Han P, et al. Immunohistochemical detection of differentially localized up-regulation of lysyl oxidese and down-regulation of matrix metallopreinase-1 in rhesus monkey model of chronic myocardial infarction [J]. Exp Biol Med， 2012, 237(7): 853-859.

[6] 劉會, 榮季冬, 張曙影, 等．阿托伐他汀對慢性心力衰竭小鼠心肌組織賴氨酰氧化酶表達的影響[J]．中華老年心腦血管病雜志, 2013, 15(6): 628-631．

Effects of rosuvastatin on expression of lysyl oxidase in rat heart with dilated cardiomyopathy

LiuHui1,YangLong1,RongJidong2,JiangZhi,WangJiren.

1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China. 2.DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege, 563003,Guizhou,China.

Objective To explore the effects of rosurvastatin on expression of lysyl oxidase (LOX) in myocardial tissue of rats with dilated cardiomyopathy (DCM).Methods Fifty SD rats were randomly divided into 3 groups which were control group (n=10, equivalent normal saline was intraperitoneal injected), DCM group (n=20, 2.5 mg·kg-1adriamycin was intraperitoneal injected every time, one time every week for 6weeks), and treatment group (n=20, 2.5mg·kg-1adriamycin was intraperitoneal injected every time, one time every week for 6weeks, gastric lavage in rosurvastain 3 mg·kg-1·d-1at the same time). At the end of week 10, mice were sacrificed, HE and Masson pathological staining, analysis of degree fibering in the myocardial tissue, expression level of LOX mRNA and protein in myocardial tissue of DCM rats were measured by RT-PCR and western blot (WB).Results HE and Masson pathological staining was shown myocardial tissue significantly fibering in DCM group than that in control group, and significantly decreased in treatment group. The expression level of LOX mRNAs and protein were significantly increased in DCM group than that in control group (P<0.01), and were significantly decreased in treatment group than that in DCM group (P<0.01).Conclusion rosurvastatin can attenuate the increased-expression of LOX and fibering in myocardial tissue of DCM rat.

Dilated cardiomyopathy； Protein-lysine 6-oxidese； Rosurvastatin

R-332

A

1000-744X(2016)08-0787-03

2016-03-06)

△通信作者，E-mail：yanglong1001@163.com