豬精液體外低溫保存技術新進展

李新紅，李步社

（1．上海交通大學農業與生物學院，上海市獸醫生物技術重點實驗室，上海 200240；2．上海祥欣畜禽有限公司，上海種豬工程技術研究中心，上海 201302）

豬精液體外低溫保存技術新進展

李新紅1*，李步社2

（1．上海交通大學農業與生物學院，上海市獸醫生物技術重點實驗室，上海 200240；2．上海祥欣畜禽有限公司，上海種豬工程技術研究中心，上海 201302）

伴隨豬聯合育種的開展及人工輸精技術的推廣運用，豬精液低溫保存技術已成為研究的熱點。精液低溫保存是通過降低或抑制精子新陳代謝、維持精子質膜及頂體結構完整性，延長精子體外存活時間。主要包括：液氮超低溫（-196 ℃）冷凍保存、4～5 ℃低溫“冷休克”保存以及15～17 ℃鮮精體外保存。早期研究主要集中在低溫保護劑和技術方法的篩選與優化，對豬精液低溫保存進行了深入探索。近年來，有關豬精液低溫保存過程中抑制豬精子低溫損傷、延長精子的存活壽命及提高精子的受精能力等研究取得突破性進展。該文就近年來不同保存技術、保護劑及未來重點解決的問題進行簡要概述，旨在為開展相關研究以及實際生產應用提供理論參考。

豬精液；低溫保存；人工輸精

0 前言

生態環境壓力、飼料成本、疾病防控、國際市場競爭以及市場波動等諸多因素制約著我國生豬規模化養殖的發展。尤其是“十三五”期間國家生豬養殖“約束發展區”的規劃實施，推進生豬改良及聯合育種，加快生豬養殖業轉型升級是破解制約當前產業發展的關鍵。豬人工輸精技術及豬精液體外保存是生豬聯合育種的前提基礎，豬精液體外保存期較短、精液中病原菌的存在成為阻礙限制生豬改良及實施聯合育種的兩大主要因素，在一定程度上限制生豬養殖產業的轉型升級及產業化發展。優質種豬精液體外保存方式主要采用液氮超低溫（-196℃）冷凍保存、4～5℃低溫“冷休克”保存以及15～17℃鮮精體外保存。目前，生豬養殖業中主要利用新鮮精液人工輸精繁殖為主，但所使用的鮮精液體外保存的時間一般不超過3 d，鮮精體外保存時間短且精子質量下降較快，極大影響公豬精液的利用效率，致使公豬保有量增加，影響養殖的經濟效益，故限制生豬改良及聯合育種的推進。因此，構建豬精液體外超低溫冷凍保存長期保存體系及4～5℃低溫“冷休克”保存體系，提高優質種公豬利用率是當前生豬養殖業亟待解決的問題。本文對近五年來豬精液體外低溫保存技術相關研究進行簡要概述。

1 超低溫冷凍保存技術進展

超低溫冷凍是豬精液體外保存常用的技術之一，然而過去一直處于瓶頸狀態，其原因主要是豬精子質膜中富含不飽和脂肪酸，極易受到冷凍應激傷害失去穩定性和選擇通透性，Ca2+、和稀釋液中的一些成分進入精子內，擾亂精子生理平衡，促使蛋白質和mRNA降解，導致凍融精子質膜、頂體及核的穩定性遭到破壞，線粒體功能和精子活力及存活率顯著降低，人工授精妊娠率及窩產仔數均有所降低[1]。因此，2013年以前世界上應用豬冷凍精液進行人工授精的母豬量不到1%[2]。近年來，超低溫冷凍保存技術取得快速發展，稀釋防凍保護劑的改進、冷凍及解凍速率優化、乳化劑及抗氧化劑的運用，豬凍融精子頂體、質膜結構完整性及核遺傳物質結構穩定性均得到顯著提高，豬凍精繁殖效率已經達到甚至略優于鮮精指標。

卵黃和乳糖是最常用的豬冷凍精子非滲透性保護劑，免受精子低溫應激傷害，阻止Ca2+內流。一些高分子化合物（如：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇和葡聚糖）亦提高冷凍保護作用。甘油、二甲亞砜（DMSO）、乙烯、甲醇、丙烯和二甲基乙酰胺是豬冷凍精子滲透性保護劑，其中甘油適宜濃度為2%～3%。非滲透性冷凍保護劑作用于細胞外，同時可以提高滲透性保護劑的保護性能[3]。如主成分十二烷基磺酸鈉的Orvus ES Paste，一種表面活性劑，促進卵黃蛋白和精子質膜的相互作用。冷凍程序也有進一步優化，尤其是兩步降溫法保存以及麥細管于40 ℃水浴中解凍等程序的優化顯著提高凍融精子的活力等宏觀指標。實驗證明，添加50%精清的保護效果優于添加10%的精清。豬精子在超低溫冷凍保存過程中除受到低溫機械損傷外，還要遭受ROS等自由基的氧化損傷。因此，抗氧化劑是豬精子超低溫冷凍保存技術中常用的成分。近年來研究證實，冷凍稀釋液中添加抗氧化劑可以增加凍融精子的質量以及人工授精后的繁殖效率。然而，并非所有的抗氧化劑都能提高豬凍融精子的質量及受精潛能。研究顯示，還原性谷胱甘肽、L-半胱氨酸、α-生育酚、丁基苯甲醇和維生素C對于超低溫冷凍保存豬精子是較為有效的抗氧化劑。此外，抗氧化劑的結合使用能夠有效提高凍融精子人工輸精的產仔數，例如維生素C結合還原型谷胱甘肽共同使用，能有效提高豬凍融精子的質量。

此外，輔助保護劑以及子宮深度輸精技術有利于提高凍精的繁殖效率。丹參多糖、丁羥甲苯、前列腺素F2α以及咖啡因與氯化鈣的聯合使用顯著提高凍融精子的活力；含一定量膽固醇的環糊精（CLCs）有利于增強凍融精子的抗凍性，尤其是用來提高凍融質膜中膽固醇的豐度及精子的質膜完整性。人工輸精主要包括傳統體內或者子宮頸內輸精、子宮內輸精以及子宮內深度輸精3種方式，繁殖生產實踐證實子宮內深度輸精適合豬凍精繁殖生產。盡管在豬精液冷凍保存技術方面取得顯著成績，受胎率及產仔數已經達到甚至略高于鮮精繁殖指標。然而，國內外豬凍精繁殖生產存在的共性問題是受限于制備凍精的鮮精液質量，活力低于0.8的精液不利于制備凍精，因而限制了種公豬精液的凍精制備利用率，這也是未來研究需要解決的主要問題。

2 4～5 ℃低溫“冷休克”保存技術進展

相對于液氮超低溫冷凍保存，4～5 ℃低溫“冷休克”保存能有效減少液氮冷凍所產生的機械損傷，同時能有效節約生產成本。同時，低溫“冷休克”精子代謝水平低于37℃條件下的代謝水平，能有效緩解精子能量的消耗。生產運輸成本和操作技術與常溫精液基本相同，有效提高優良種畜利用率及聯合育種的推廣，具有很廣的應用前景。過去豬精液體外保存相關研究主要集中于液氮超低溫冷凍保存和鮮精15～17 ℃保存，而4～5 ℃低溫保存研究較少。近年來，大多數研究主要集中于精液4～5 ℃保護劑的篩選、代謝調控以及抗氧化劑的篩選[4]。其中糖代謝是家畜精子能量的主要來源之一，而葡萄糖、果糖及蔗糖是常用的保護劑成分，亦是主要能量來源物質。盡管不同稀釋液的研究試驗方法和使用效果不同，其組成主要由葡萄糖、果糖、檸檬酸（鈉）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化鈣、碳酸氫鈉等成分構成，作用包括營養、pH調控、緩沖性、滲透壓和低溫保護性能等。目前，脫脂奶粉的加工工藝已經達到先進水平，有害細菌數已完全符合世界衛生組織標準，所以較多研究者傾向于向精液稀釋液中添加脫脂奶粉。Pagl等(2006)研究證實，在精液4～5 ℃保存添加脫脂奶粉可以有效維持精子活力約兩周，甚至在4～5 ℃條件下保存豬精液脫脂奶粉的效果要優于全乳，故脫脂奶粉在豬精液稀釋液中的應用更加廣泛。研究證實，牛奶中的乳鐵傳遞蛋白對維持精子活力、運動能力和獲能發揮重大作用。此外，添加奶類物質可以降低精液中電解質濃度，調節精液滲透壓，從而保護精子質膜的完整性及線粒體的活性。精子代謝過程中相應酶活性是代謝信號通路激活的關鍵，尤其是GAPDH、AMPK的活性以及線粒體活性直接調控精子代謝過程。因此，2～5 ℃低溫“冷休克”保存過程中，豬精子酶活性以及線粒體活性的維持對復蘇后精子的活力及壽命起到至關重要作用。

此外，精子體外保存過程中的活力降低與精液中富集的活性氧離子（ROS）密切相關。豬精子質膜中含有高濃度的不飽和脂肪酸，極易發生氧化損傷，病理水平下ROS導致精子質膜發生氧化應激[5]。因此，精液稀釋液中添加抗氧化物質尤為重要，能減少精子細胞內多余的ROS生成量，抵抗ROS造成的氧化壓力，提高精子自身的抗氧化特性，維持精子活力，延長體外保存時間。常見的抗氧化劑包括酶類抗氧化劑（如：過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等）和非酶類抗氧化劑（如：維生素C、維生素E、半胱氨酸）等。研究證明，不同抗氧化劑的使用對于豬精子體外4～5 ℃保存均有積極效應。目前，4～5 ℃低溫“冷休克”保存豬精子的存活時間能達到10 d，活力能夠維持在0.5以上。但尚無4～5 ℃低溫條件保存的豬精子人工輸精后母豬受胎率、產仔數等繁殖指標報道。

3 鮮精15～17 ℃保存技術進展

鮮精體外15～17 ℃保存是國內外現普遍采用的豬精液保存技術方法，其人工輸精繁殖效率與自然交配繁殖相似。然而體外保存時間相對較短，有效利用期不超過5 d，因而極大限制鮮精的利用率。隨著養豬業人工授精技術的發展，對豬精液15～17 ℃條件保存所用的稀釋劑成分及添加物提出更高要求，尤其是強化精子宏觀指標檢測，準確反映精子有效存活期及質量特性，為指導實際生產奠定理論基礎。近年來，研究重點主要集中在稀釋劑成分及抗氧化劑的篩選，除常規使用的葡萄糖、檸檬酸（鈉）、氯化鈣、碳酸氫鈉及三羥甲基氨基甲烷（Tris）等稀釋劑成分之外，BSA、脫脂奶粉及環糊精等成分亦用作豬精液15～17 ℃保存稀釋劑成分，能有效提高豬精子體外保存的活力參數指標，延長精子存活壽命，使保存的豬精液有效利用期增至5 d以上，顯著提高優質種公豬精液的利用率。Fu等（2017）利用超聲處理過的脫脂奶粉，17 ℃保存豬精液7 d后，精子GAPDH活性、線粒體膜電位及ATP含量顯著高于對照組，添加BSA及脫脂奶粉的處理組能有效抑制豬精子蛋白的脫磷酸化及乙酰化[6]。Carla等（2017）利用蔗糖及糖分解酶17 ℃保存豬精液，保存10 d后能顯著提高精子活力、前向性運動、質膜完整性以及頂體完整性。選取135頭母豬進行生產性實驗，受孕率及產仔率分別為97.8%、96.3%，證實添加蔗糖及糖分解酶能夠滿足17 ℃保存過程中豬精子的代謝需求[7]。

過氧化損傷是精子體外保存過程中誘導活力降低重要因素之一。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽、維生素C及維生素E、牛磺酸、硫辛酸等是超氧化物和過氧化氫的抗氧化劑，添加抗氧化劑能有效提高精子的抗氧化損傷能力。Li等（2017）在豬精液稀釋液中添加不同濃度的牛磺酸顯著提高17℃精子的活力、存活時間及抗氧化能力，保存7 d后精子活力達到0.5以上；Zhang等（2016）在稀釋劑中添加5 mmol/L谷胱甘肽，能有效延長豬精子17℃保存的存活時間，顯著提高精子活力、質膜及頂體完整性、抗氧化能力（T-AOC），降低MDA及H2O2水平[8]。Zhang等（2016）在稀釋劑中添加不同濃度的超氧化物歧化酶（SOD），其中濃度200 U/mL SOD處理組精子活力、質膜完整性及頂體完整性、T-AOC顯著提高，MDA與H2O2水平顯著降低[8]。Fang等（2017）研究證實，稀釋劑中添加80μM碘甲硫氨酸(IM)17℃保存6 d后，精子活力、質膜及頂體完整性沒有顯著變化，但80μM碘甲硫氨酸組產仔數明顯高于對照組，且能有效抑制豬精液中變形菌、葡萄球菌等細菌微生物的擴繁。

4 豬精液中病原微生物的影響及應對措施

豬精子中不飽和脂肪酸含量高致使其對低溫損傷較為敏感是限制豬精液低溫保存技術發展的一個主要因素。除此之外，豬精液普遍存在的細菌、病毒等病原微生物亦是影響豬精液低溫保存宏觀指標的又一大限制性因素。研究證實，豬精液中含有50多種細菌微生物，如大腸桿菌、變形桿菌、沙雷菌、腸桿菌、克雷伯菌、葡萄球菌、鏈球菌和假單胞菌等[1]。無論是17 ℃保存，還是4～5 ℃低溫保存，均會對精子活力、成活率、質膜及頂體結構產生較大的破壞作用[9]。豬精液中細菌等微生物部分屬于內源性，來自于公豬的包皮、尿道、外生殖器及泌尿生殖感染等因素均可能導致精液被細菌污染，而多數來自采精器具、稀釋液及保存環境等人為過程中缺乏相應的衛生條件，尤其高溫季節病原菌的滋生以及耐藥性病原菌的產生，是精液中病原菌防控的難題，而傳統病原菌防控策略已經無法滿足實際生產需求。低溫保存過程中細菌等病原菌對豬精子質量產生較大的影響，主要體現誘導精子發生凝集現象[10]，降低精子運動參數等質量特性，誘發破壞精子頂體完整性，抑制精子特異性蛋白質磷酸化水平[11]，降低精液pH以及母豬產仔數等生產性能[12]。豬精液中細菌菌落濃度一般為103～105cfu/mL，而菌落濃度大于103cfu/mL時會對精子質量造成不良影響。有關細菌與豬精子質量的研究常用商用菌種作為實驗材料，而這些菌株一般具有高致病性，無法準確評估精液中細菌對豬精子的影響。目前家畜精液中病原菌的存在已經引起國外飼養業廣泛重視，美國、法國、加拿大及巴西等國家陸續開展家畜動物精液中細菌等微生物病原菌的防控研究，尤其抗生素耐藥菌的種類篩選、防治以及致病機理方面已經取得初步成效，為進一步開展精液中病原菌的防治研究以及相關新產品研發奠定基礎。

5 小結與展望

綜上所述，豬精液低溫保存技術有所突破，尤其是保護劑成分的篩選、優化以及抗氧化損傷方面取得突破性進展。然而，豬精液中病原菌的存在、高溫季節精子質量顯著降低等限制性因素影響低溫保存精子質量，豬精液低溫保存技術尚需進一步改進提高，未來相關研究重點主要聚焦以下幾方面：一是液氮超低溫冷凍保存技術在原有保護劑成分基礎上尚需進一步優化，維持凍融精子結構完整性及精子膜通透性，維持精子中關鍵蛋白結構及修飾的生物學功能，克服凍精繁殖效率低的瓶頸，提高活力相對較低的精液凍精利用率；二是在糖代謝及氧化磷酸化生理調控基礎上，有效延長精子低溫體外保存時間，深入了解和揭示低溫保存過程精子活力降低的分子機理，建立4～5 ℃豬精液體外保存技術體系；三是新鮮精液15～17 ℃保存過程中細菌等病原微生物的防控研究，開展家畜精液病原微生物多樣性分析、感染家畜動物精子的致病機理以及綜合防治研究，制定家畜動物精液病原菌安全標準，構建家畜動物病原菌的防控體系，擴大養殖企業生存和發展空間，實現地區養豬業加快轉型升級及可持續循環發展是目前亟待解決的問題。通過結合低溫生物學的相關知識及對精子低溫損傷分子機理探索，可為豬精液低溫存研究提供理論指導，最終提高優質種公豬的高效利用率及繁殖效率。

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上海市科技興農重點基礎研究項目：滬農科基字（2014）第2-5號；國家自然科學基金項目：31772594

2017-09-26）