豬傳染性胃腸炎診斷技術的研究進展

楊 偉，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，石遠菊，葉 麗（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬傳染性胃腸炎診斷技術的研究進展

楊 偉，湯德元*，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，石遠菊，葉 麗（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起豬只的一種高度接觸性胃腸道傳染病，臨床癥狀主要表現為腹瀉、嘔吐和脫水，該病為影響養豬業健康發展的重要疫病之一，世界動物衛生組織將其列為法定報告的B類動物疫病。近年來，國內外許多研究者在對豬傳染性胃腸炎的診斷與檢測方法上進行了大量的研究，并建立了相關的實驗室診斷檢測技術，這些檢測技術主要包括病理診斷、病毒的分離鑒定、電鏡檢測、血清學診斷和分子生物學診斷方法等。本文對豬傳染性胃腸炎主要的診斷技術進行了綜述，以期為該病在臨床的快速診斷及防控提供參考。

豬傳染性胃腸炎；病原學；血清學；分子生物學；診斷

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起豬只的一種高度接觸性胃腸道傳染病，TGEV破壞小腸上皮細胞而引起腸絨毛萎縮，該病臨床主要表現為腹瀉、嘔吐和脫水，對不同豬種和不同年齡的仔豬都易感，而對成年豬的危害性相對較小。該病在1946年由Doyle和Hutchings[1]在美國首次報道，隨后在世界許多國家和地區相繼報道了本病的發生；我國在20世紀60年代首次報道了TGE在我國的流行；近年來我國各地不同程度地暴發了豬傳染性胃腸炎，給生豬養殖產業帶來了巨大的經濟損失。由于豬傳染性胃腸炎（TGE）與豬流行性腹瀉(PED)在臨床癥狀、流行病學等方面的表現非常相似，給臨床診斷以及防治都帶來了一定困難。因此，掌握TGE檢測技術對該病的診斷和防治均有重要的意義。豬傳染性胃腸炎的實驗室診斷主要包括病理診斷、病毒的分離鑒定、電鏡檢測、血清學診斷和分子生物學診斷方法，現就這些診斷技術的研究進展綜述如下。

1 TGE的臨床及病理診斷

1.1 臨床診斷

根據流行病學調查、發病豬臨床癥狀觀察和病理變化進行綜合診斷。TGE臨床癥狀為仔豬突然性嘔吐，水樣腹瀉。開始是灰白色糞便，然后變為黃綠色糞便，糞便中夾雜有未消化的凝乳塊，病程較久時，會出現脫水。日齡越小，病程越短，死亡率越高，隨著日齡的增長病死率逐漸降低。仔豬食欲下降，拒食；1日齡內新生仔豬發生腹瀉后3～4 d，呈現嚴重脫水而死亡，發病死亡率很高（可達100%）。保育豬、母豬癥狀輕重不一，其中癥狀輕的，超過3周齡的豬通常能夠自行恢復，但也影響發育；母豬患該病會導致泌乳量減少，因與患病仔豬長期接觸、反復感染而發病嚴重，體溫升高、嘔吐、腹瀉和厭食；與患病仔豬無接觸的母豬通常僅有輕微癥狀或無癥狀。

1.2 病理剖檢診斷

TGE剖檢的主要病變集中在胃腸道。眼觀從胃到直腸可見程度不一的卡他性炎癥。胃腸充滿凝乳塊，胃黏膜潰爛；小腸充滿氣體，腸壁彈性下降，管壁變薄，呈透明或半透明狀，或有充血、出血及潰瘍等癥狀；腸內容物呈泡沫狀、黃色、透明。小腸上皮細胞大量脫落壞死，腸絨毛變短和萎縮；正常仔豬的空腸中絨毛長度：利貝昆濾泡的深度比值是7∶1，但是在被感染TGEV的仔豬體內這個比值的大小僅僅約為1∶1；腸絨毛萎縮也常見于輪狀病毒腹瀉，但一般不如TGEV嚴重[2]。腸系膜淋巴結腫脹、充血、出血，淋巴管沒有乳糜。心臟，肺臟，脾臟，肝臟，腎臟未見明顯的眼觀病理病變。

2 實驗室診斷

2.1 病毒的分離鑒定

TGEV的分離鑒定通常用乳豬接種試驗和細胞培養2種方法。用經處理的病毒口腔感染仔豬是分離TGEV最敏感的方法，該法只有結合流行病學做出初步診斷，不排除有其他病毒感染的可能，且成本、環境及人員技術要求較高，因此，常采用細胞培養進行病毒的分離鑒定。豬腎細胞（PK15）和豬睪丸細胞（ST）是實驗室最常用的細胞。在ST或豬甲狀腺細胞上的典型細胞病變現象（CPE），呈現膨脹、圓形或長形外觀如氣球的細胞組成。第一次接種細胞可能沒有明顯的細胞病變（CPE），往往需經連續盲傳幾代后，才能使細胞發生特征性病變。Pocock和Garwes報道，當次代豬甲狀腺細胞用弱酸性營養液時，TGEV增殖滴度最高。同時，為了提高病毒對細胞的吸附，在細胞培養液中添加二甲基亞砜（DMSO）等化學試劑可以明顯提高細胞對病毒的敏感性，從而提高病毒的分離成功率。

2.2 電鏡觀察

用電鏡檢測 TGEV也是常用的診斷方法之一。通過電鏡觀察（EM），病毒多分布在胞漿的空泡里和微絨毛間隙，在微絨毛間的病毒往往呈串球狀排列。電鏡檢測顯示：除脾臟外，病毒大量分布于病豬的各種器官中，在小腸中含毒量最高。由于TGEV與PEDV等為代表冠狀病毒形態十分相似，僅僅通過電鏡觀察無法鑒別診斷，免疫電鏡法（IEH）可以更敏感確切地檢測臨床樣品或細胞培養物中的TGEV，并可提供病毒血清學鑒定。1999年王繼科等[3]利用免疫電鏡（IEH）觀察和分析，從形態上的細微差異鑒別TGEV和PEDV，為鑒別這兩種病毒粒子建立了初步診斷意義；江春霞[4]將TGEV細胞毒接種于原代豬腎細胞，進行超薄細胞切片電鏡、直接負染電鏡、免疫電鏡，在電鏡下清晰的觀察到TGEV病毒粒子。

2.3 血清學診斷

2.3.1 免疫熒光檢測

熒光抗體檢測（IFA）TGEV是一種靈敏性和特異都較好的診斷方法；此方法主要從小腸上皮細胞、腸內容物或糞便中檢測TGEV。馬思奇等[5]用免疫熒光直接法檢查扁桃體應用于活體診斷TGEV，提高了檢出率，既適用于早期感染，也適用于慢性或隱性帶毒豬的診斷；趙鑫等[6]用抗TGEV的N蛋白單克隆抗體，為TGEV 檢測方法的建立和N 蛋白功能的分析奠定了基礎；利用所制備的單克隆抗體進行間接免疫熒光對病原檢測具有較高的特異性，為鑒別診斷TGEV與PRCV（豬呼吸道冠狀病毒）的阻斷ELISA方法的建立打下了前期基礎，為TGEV與PRCV的血清學診斷提供了材料[7]。朱蘊暖等[8]建立了TGEV特異性的間接免疫熒光檢測法，對TGEV的實驗室診斷及TGEV在感染細胞中的定位和動態分布提供了有效的檢測手段。

2.3.2 中和實驗

中和試驗（SN）最早于1969年由Carbrey等人建立，其原理是病毒或毒素與相應的抗體結合后，失去對易感細胞的感染性，被稱為中和試驗。中和試驗主要用于：1）從待檢血清中檢出抗體，或從病料中檢出病毒，用于診斷傳染性病毒病；2）用抗毒素血清檢查樣品中的毒素或區分細菌的毒素類型；3）測定抗病毒血清或抗毒素效價；4）新分離病毒的鑒定和分型。中和試驗通常采用豬睪丸細胞系或豬腎細胞系培養，可作大量細胞試驗，或應用微量培養板培養單層細胞進行微量中和試驗。TGE病豬的中和抗體通常在感染后7～9 d開始出現，21 d能達到相當水平并逐漸增加，愈后血清的中和抗體持續時間較長，試驗通常采用病毒定量，血清變量法。董志珍等[9]建立以狗直腸瘤(A72細胞)進行TGEV血清中和試驗的方法，證實了A72細胞可以準確清晰地反應TGEV感染，其敏感性和準確性優于PK15細胞，且豬TGE血清中和試驗與酶聯免疫吸附檢測結果試驗的重復性較好。

2.3.3 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是國際貿易指定標準診斷TGE方法之一，ELISA具有靈敏性高、特異性好等優點，是當前應用最廣泛的一種免疫學檢測方法。Carman 等[10]用 B-ELISA 診斷TGE 抗體，可同時區分 TGEV 和PRCV的抗體，取得了良好效果。鐘濤等[11]利用重組N蛋白作為診斷抗原，建立了一種快速的TGEV抗體間接ELISA檢測方法，可用于免疫豬群TGEV的監測和診斷。鄒勇等[12]建立了同時檢測和鑒別豬流行性腹瀉病毒、TGEV和輪狀病毒抗體的ELISA技術。姜騫等[13]將重組TGEV的N基因利用大腸埃希氏菌進行原核表達，經Ni-NAT層析柱純化獲得N蛋白，以該蛋白制備抗原，建立了Dot-ELISA診斷技術，用肉眼即可判定結果， 無需特殊設備條件，快速簡便， 適合基層進行抗體檢測。

2.4 分子生物學診斷方法

2.4.1 RT-PCR診斷

RT-PCR成為一種應用非常普遍、特異、敏感的檢測方法，可從微量的核酸樣品中檢測出RNA序列，根據PCR產物的電泳結果和預測的核酸分子量大小對比，可以判定檢測樣品中是否有TGEV的存在，優于傳統的血清學和免疫學方法。RT-PCR技術能快速檢測感染組織中的豬傳染性胃腸炎病毒。Woods等 ( 1997年) 建立了TGEV的RT- PCR 檢測技術，結果證實 RT- PCR是一種非常特異、敏感的診斷方法。李軍等[14]建立了檢測TGEV的RT- PCR方法，可檢出l pg的TGEV RNA含量。趙雯雯等[15]利用國內外已發表TGEV和PEDV基因序列和相關RT-PCR方法，根據TGEV的S基因和PEDV的S基因各設計一對特異性通用引物，建立了TGEV和PEDV二聯RT-PCR檢測方法，為TGEV和PEDV的檢測和流行病學調查奠定了基礎。沈海蛾等[16]應用套式PCR檢測和區分TGEV和PRCV的試驗中發現，該種方法特異性強 ，能夠區 分 PRV、PRCV、PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV和PPV等多種病毒。

2.4.2 多重RT-PCR技術

多重 PCR可用于同時檢測兩種或兩種以上的病毒，具有高效性、系統性和經濟簡便性。多重PCR法是采用多對引物，在一個反應中擴增多種靶序列，解決了逐一分離每個待測樣品中病毒的問題。Jung等[17]為了增強鑒別診斷 PEDV和TGEV方法的靈敏性，在多重 RT-PCR 技術的基礎上建立了斑點雜交技術。Kim O和Choi C[18]用改進的多重 RT-PCR方法來區分PEDV和TGEV，在 RT-PCR反應體系中分別加入了針對TGEV和PEDV基因特定保守區域的兩對引物，兩者通過 RTPCR 反應的產物分別為412個bp和612個bp的 DNA目的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以鑒別PEDV和TGEV。2010年張坤和何啟蓋[19]建立了能同時檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬A群輪狀病毒(GAR)的多重RT-PCR檢測方法，該方法檢測PEDV、TGEV、GAR的敏感性分別為92%、100%、100%， 特異性均為100%。該方法敏感性高、特異性強， 具有較高的實用價值， 可應用于臨床鑒別診斷， 也為這3種病毒性腹瀉的流行病學調查奠定了基礎。

2.4.3 熒光定量RT-PCR技術

近些年來熒光定量 RT-PCR得到越來越多的應用，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。董玲娟等[20]根據TGEV的N基因序列設計了一對特異性引物，擴增目的片段，構建質粒，對熒光定量的反應體系和條件進行優化，建立了TGEV熒光定量RT-PCR檢測方法，該方法的特異性高、重復性好、敏感性比普通PCR檢測方法高2個數量級，可以對TGEV進行快速檢測。肖文[21]選擇TGEV的N蛋白基因突變小的區域，設計引物并克隆出陽性標準品，并通過得到的標準曲線建立的熒光定量RT-PCR方法，該方法能夠檢測出最低的TGEV的DNA含量為1.445×10-6ng/μL，與常規RT-PCR方法進行比較，得到該方法的敏感性比常規RT-PCR方法要高出約100倍。與常規 RT-PCR相比，熒光定量RT-PCR特異性更強、敏感性更高，假陽性率低，不易污染，且擴增與檢測一步完成，不需要對產物進行電泳等后期處理，操作更簡便。

2.4.4 限制性酶切片段長度多態性技術(RFLP)

RFLP 是一種區分具有抗原相關性病毒的試驗方法，把抗原性相近的病毒核酸用特定的限制性內切酶酶切，通過對酶切的產物進行分析，從而區分被檢病毒核酸。Kwon HM和Saif LJ等[22]對TGEV和PRCV核酸的差異性進行了分析，證明了在某些特定區域的堿基變化與該分離株的毒力強弱相關。Jackwood DJ和 Kwon HM[23]將TGEV的RT-PCR產物用限制性內切酶Sau3AI進行酶切，然后對S基因5′端的酶切圖譜進行分析比較，得出的結論是該酶可將TGEV分成四個組，幾種限制性內切酶聯合使用，通過對酶切圖譜的分析可以區分出TGEV的Purdue株和Miller株。

2.4.5 核酸探針技術

目前，己建立了用核酸探針雜交技術檢測糞便樣品、感染組織或感染細胞中的TGEV，用這些探針可區別不同TGEV毒株。曹三杰等[24]用PCR擴增制備TGEV的靶基因并進行純化，經過系列參數的對比篩選，選擇構建檢測芯片的最適靶基因，進行基因芯片探針最佳標記方法試驗，取得了較好效果。

2.4.6 原位雜交技術

原位雜交是在研究DNA分子復制原理的基礎上發展起來的一種技術。原位雜交利用標記的已知核酸探針，在組織、細胞及染色體上檢測特異的 DNA或RNA序列。原位雜交使用的核酸探針可以是放射性探針（如32P標記），也可以是非放射性探針（如地高辛標記）。Sirinarumitr T等[25]使用了含有TGEV S基因部分序列的兩種質粒，成功檢測了接種于細胞培養物上和自然感染病變肺臟組織中的TGEV和PRCV。

自1946年TGE發現并報道至今，豬傳染性胃腸炎仍然在全世界各個國家和地區流行，給生豬養殖業造成了巨大經濟損失。引起了國內外學者的廣泛關注和研究，并得出了許多關于TGEV診斷技術的成果，越來越多的診斷技術應用于TGEV的診斷。在眾多的診斷技術中，在診斷上具有各自方法的優點，但是在這些診斷技術中都有著其各自的局限性，因此要根據試驗的目的要求，并結合具備的條件選擇適宜的檢測方法對豬傳染性胃腸炎進行診斷。進一步開展TGEV診斷方法的研究是有必要的，實現診斷方法的便捷化、快速化和診斷試劑的商品化，同時，應將各種診斷方法有機結合起來，取長補短，以期達到最佳的檢測結果，為及時和快速檢測豬傳染性胃腸炎，為本病的綜合防治提供技術保障，以減少本病造成的經濟損失，為我國養豬業的健康發展提供有力支持。

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貴州省2017年農業攻關項目資助(黔科合支撐[2017]2579號)

楊偉(1993-)，男，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學的科研學習

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導師，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫結合的教學科研工作。E-mail:tdyuan@163.com

2017-09-05）