豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

胡玲玲，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，龍冬梅，石遠(yuǎn)菊，楊 偉，葉 麗

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

胡玲玲，湯德元*，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，龍冬梅，石遠(yuǎn)菊，楊 偉，葉 麗

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬繁殖與呼吸綜合征又稱豬藍(lán)耳病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一，2006年我國自南向北大面積暴發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，目前該病在我國有的地區(qū)又出現(xiàn)不斷發(fā)病的事態(tài)，在整個防控過程中快速準(zhǔn)確的診斷方法與技術(shù)對診斷豬繁殖與呼吸綜合征至關(guān)重要。本文主要從豬繁殖與呼吸綜合征的病毒的分離鑒定、血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷等方法及技術(shù)的新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防控提供一定的理論支持和參考依據(jù)。

豬繁殖與呼吸綜合征；病原學(xué)診斷；血清學(xué)診斷；分子生物學(xué)診斷

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以感染妊娠母豬晚期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、早產(chǎn)、木乃伊胎和弱胎，各種年齡豬（特別是仔豬）呼吸障礙、厭食為特征的高度傳染性疾病，在美國最早發(fā)生該病。荷蘭人Wensvoot等1991年首次于發(fā)病仔豬和母豬體內(nèi)分離到了該病毒，當(dāng)時被稱為Lelystad病毒。隨后很多國家也相繼分離到此病毒。郭寶清等(1996)首次從國內(nèi)有相似癥狀發(fā)病豬群中分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒，從此代表該病在我國的存在。楊漢春[1]闡述PRRSV有2個血清型，即美洲型（代表毒株為VR-2332株）和歐洲型（代表毒株為LV株），歐洲和美洲分離株毒株之間存在明顯的抗原差異性。在對我國分離毒株的基因組進(jìn)行分析表明，目前在我國流行的毒株均屬于美洲型，并沒有發(fā)現(xiàn)和分離到歐洲型毒株。湯德元等[2]分析了美洲型的PRRSV，其可分為4個亞群，我國現(xiàn)今流行的PRRSV毒株屬于四個亞群中的3個亞群，即以PRRSV BJ-4株為代表的屬于1亞群；以HB-1(sh)/2002、CH-la和HB-2(sh)/2002株為代表的屬于2亞群；以BJ-13為代表的屬于4亞群。本病傳播迅速，尤其在養(yǎng)豬技術(shù)進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家，由于豬群密集、流轉(zhuǎn)頻繁，更易引起流行。目前，各國對本病進(jìn)行了大量深入的研究。PRRS可危害各種日齡階段的豬，并且臨床表現(xiàn)多樣，同時引起細(xì)菌病或病毒病等繼發(fā)感染，導(dǎo)致臨床癥狀的復(fù)雜化。因此，僅根據(jù)臨診癥狀及流行病學(xué)特點很難做出診斷，此病的診斷必須借助于實驗室診斷技術(shù)。本文主要對近年來實驗室對豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法的進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防控提供一定的理論支持和參考。

1 病毒的分離鑒定

病毒的分離鑒定是目前病毒病最真實的一種診斷方法。常用于PRRSV分離的細(xì)胞主要有豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMS）、非洲綠猴腎細(xì)胞（MA-104、CL-2621、Marc-145等），以及克隆自Marc-145的更敏感的HS．2H細(xì)胞。但分離PRRSV歐洲株只能用PAM細(xì)胞[3]該病毒的分離可來源于血清、肺臟、肺泡灌出物、脾臟、淋巴結(jié)和扁桃體，尤其以血清和肺臟組織分離成功率最高；較易從急性感染病例豬中分離到PRRSV；據(jù)有關(guān)報道PRRSV在死胎和新生仔豬中分布情況不一致，流產(chǎn)在死胎脾臟和淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞分布含量比較多，而新生仔豬則常見于肺臟。采集后的樣品應(yīng)冷藏或冷凍運輸和保存，將采集的樣品經(jīng)過處理后接種于長滿的單層PAMs細(xì)胞后1～4 d即可出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），細(xì)胞最初呈現(xiàn)灶狀變圓、膨大，隨后皺縮，脫落形成拉網(wǎng)空洞。當(dāng)接種于CL-2621細(xì)胞時，CPE出現(xiàn)得比較緩慢，需在感染后2～6 d才會侵染細(xì)胞單層。PRRSV在接種于Marc-145細(xì)胞48 h即可出現(xiàn)典型的CPE變化，具高度敏感性。由于致病力的不同，不同分離株在細(xì)胞培養(yǎng)上生長情況各異，甚至有些病毒株并不出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，與此同時，必須同時結(jié)合間接免疫熒光試驗（IFA）和免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）等病原檢測方法進(jìn)行驗證。

2 血清學(xué)診斷方法

血清學(xué)試驗是一種相對較于傳統(tǒng)的PRRSV診斷方法，在病毒抗原和抗體的檢測用得比較廣泛。血清學(xué)實驗有其較強的特異性，但在敏感性上有所欠缺。

2.1 中和試驗

在對PRRS V抗體進(jìn)行檢測的過程，中和試驗（SN）對PRRSV的抗體特異性是很好的，但是由于中和抗體出現(xiàn)的時期比較晚，需在感染后4～5周才能首次檢測到VN抗體，感染后的10周達(dá)到最高，在大部分的臨床檢測PRRSV新近病例中，與IPMA、IFA、ELISA作比較其敏感都低于它們，所以SN不適用于對PRRSV感染的早期診斷。Yoon等[4]對中和試驗進(jìn)行了改良，其改良內(nèi)容是加入20%的豬新鮮血清增加補體的量，目的是為了提高檢測敏感性，在感染后9～11 d即可檢出較高滴度的VN抗體。但該方法也對環(huán)境、人員的技術(shù)要求高，目前也大多局限在實驗室做研究用。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

Albina等將PRRSV接種在PAM細(xì)胞上，以制備陽性抗原和模擬抗原，首次建立了檢測PRRSV抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（EL ISA），許多結(jié)果表明ELISA具有與IPMA一樣的特異性，并且敏感性更高，如今商品化的間接ELISA診斷試劑已在全球范圍內(nèi)廣泛使用。羅長保等將ATCCVR-2332株接種Hs．2H細(xì)胞，制備抗原，以血清抗體與模擬抗原反應(yīng)的d450 nm值作為標(biāo)準(zhǔn)，從而建立了用于血清中PRRSV抗體的間接ELISA方法[5]，實驗結(jié)果顯示，有著與IFA相同的特異性，更高敏感性。王剛等用差速離心法提純抗原，以NC膜做載體，成功地建立了Dot-ELISA，并與IFA具有相同的特異性，敏感性高于IFA[6]。仝利劍等建立抗體雙抗原夾心ELISA方法，利用此重組融合N蛋白建立了一種檢測PRRSV特異性抗體的雙抗原夾心ELISA，并通過與商品化試劑盒的應(yīng)用比較對該方法進(jìn)行了系統(tǒng)評價[7]。分析了來自北京、山東、河南、河北4省區(qū)多個養(yǎng)豬場的近300份血清，總體的特異性和敏感性都較高。就目前看來，ELISA方法快速靈敏，特異性和敏感度均較高，操作簡便，結(jié)果能自動顯示，對于大批量血清樣品的檢測也實用。

2.3 間接熒光抗體試驗

間接熒光抗體試驗與免疫過氧化物酶單層試驗具有一樣的特異、敏感性，如今在歐洲和北美的許多國家得到了普遍的使用。在我國也有自己生產(chǎn)的IFA和微量IFA診斷試劑盒供應(yīng)。可以從感染6 d后的豬體內(nèi)檢測到PRRSV抗體，在30～50 d時抗體達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，直至4～6個月后抗體消失，但該方法需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，需用倒置顯微鏡觀察，結(jié)果不能自動顯示，對所需環(huán)境和人員的要求高，不適合大規(guī)模監(jiān)測；并且，IFA與IPMA只能檢測出與實驗用PRRSV抗原性相近的PRRSV分離株。

2.4 免疫過氧化物酶單層試驗

免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）方法是歷史最長的檢測PRRSV抗體的方法，在歐洲國家被普遍使用，IPMA具有較高的敏感性和特異性，能在病毒感染6 d后豬體中檢出PRRSV抗體，該方法是基于PAMs、Cl-2621、Marc-145等細(xì)胞系上進(jìn)行完成的，不好的是由于母豬血清和4周齡內(nèi)的仔豬血清可以與對照的巨噬細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致背景著色，從而影響結(jié)果的判定，且結(jié)果不能自動顯示，具一定的主觀性；同時還需細(xì)胞培養(yǎng)和倒置顯微鏡觀察，費力費時，大規(guī)模檢測費高，也不利于推廣應(yīng)用[8-9]。

2.5 乳膠凝集試驗（LAT）

王忠田等[10]利用純化的PRRSV重組M蛋白致毒乳膠制成乳膠抗原，成功地將LAT用于PRRSV血清抗體的檢測，具有良好的特異性。用LAT與IDEXX公司抗體檢測試劑盒同時對76份豬血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明LAT的特異性和敏感性均為95%，與IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒的總符合率為87%，檢出率基本一致。因LAT具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強、價格低廉且可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，是一種適合基層檢測PRRSV血清抗體的新方法。

2.6 膠體金抗體檢測技術(shù)

崔尚金等建立豬繁殖與呼吸綜合征膠體金抗體檢測技術(shù)，運用膠體金標(biāo)記純化后的PRRSV基因工程表達(dá)抗原，以一種微孔濾膜為固相載體，以紅色膠體金為標(biāo)記物的檢測PRRSV抗體的膠體金免疫層析法（GICA）[21]。特異性交叉試驗證明，GICA檢測PRRSV抗體有較高的特異性，與其他方法對比檢測證實了其敏感性，生產(chǎn)了一批免疫膠體金試紙條，檢測36份臨床樣本，其中30份經(jīng)免疫膠體金試紙條及ELISA、免疫熒光檢測均為陽性。豬繁殖與呼吸綜合征免疫膠體金抗體檢測技術(shù)的建立為檢測PRRSV抗體提供了一種快速簡便的方法。當(dāng)然，目前國內(nèi)一些大專院校也建立了更為方便、快速的診斷方法，如乳膠凝集試驗和間接血凝試驗，但其在敏感性、特異性和試劑的重復(fù)性、穩(wěn)定性上均有待提高。

3 PRRSV的分子生物學(xué)診斷

3.1 RT-PCR檢測

PRRSV的RT-PCR檢測在許多研究及檢測診斷實驗室已普遍使用，且敏感度達(dá)到了pg水平。Suarez等建立了檢測PRRSV的RT-PCR方法，該方法敏感性好，并可檢出隱性感染。Mar-Dassi等通過設(shè)計特異性的上下游通用引物，建立了鑒別診斷北美加拿大株和歐洲株P(guān)RRSV的 RT-PCR診斷方法，該方法在組織中檢測時敏感性高于IFA敏感性。趙耘等建立的檢測PRRSV的套式RT-PCR法，其敏感性與RT-PCR法相同，且操作更簡單[11]。顧海洋等[12]根據(jù)豬高致病性藍(lán)耳病與低致病性藍(lán)耳病在 NSP2 基因上有 87 bp 連續(xù)缺失，從 NCBI 上下載 7 對豬高致病性藍(lán)耳病保守序列設(shè)計一對引物。通過 RT-PCR 方法進(jìn)行檢測證明實驗室所保存的這兩株毒株分別為豬高致病性藍(lán)耳病和低致病性藍(lán)耳病，并且建立了豬高致病性藍(lán)耳病與低致病性藍(lán)耳病的檢測方法。

3.2 實時熒光定量PCR

在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)可定量PCR。實時熒光定量PCR技 術(shù)（real time fluorescent quantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR） 于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它的原理是在PCR反應(yīng)體系中添加合適的熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，隨后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知目的片段進(jìn)行定量分析的手段。該方法不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，并且具有高靈敏度、特異性和可靠性更強、自動化程度高、實時性和準(zhǔn)確性等特點，如今已普遍用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等各類領(lǐng)域。

在外國，實時熒光定量PCR技術(shù)在動物疫病的臨床診斷方面應(yīng)用也十分廣泛。Callahan等（2006）建立的real-time RT-PCR技術(shù)可以用于檢測豬精液、血清及各類組織中的PRRSV，省時省力且敏感度高于常規(guī)RT-PCR。Martinez等優(yōu)化改良了的PRRSV SYBR Green I時RT-PCR檢測方法，具有很高的特異性和敏感性，其檢出量為101．52TCID50/樣品，并通過TM值和溶曲線分析基因型，能夠很好地鑒別美洲株和歐洲株P(guān)RRSV毒株的基因型。

王宗照等根據(jù)Genbank中的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HPPRRSV）基因組序列設(shè)計1對特異性引物，建立了基于SYBR Green I實時PCR檢測HP-PRRSV的方法[13]。結(jié)果表明，該方法能夠檢測到HPPRRSV的存在，不與其他豬源病毒發(fā)生非特異性反應(yīng)。與常規(guī)PCR方法相比，兩者的符合率為100%。該方法具有快速、簡便、敏感等優(yōu)點。王榮等根據(jù)Genbank發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）M基因序列設(shè)計1對特異性保守引物，擴(kuò)增位置在M基因的14744-14846位，長度為103 bp[14]。提取PRRSV的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板建立了SYBRGreen I實時定量PCR檢測PRRSV的方法。并用該方法檢測送檢的臨床疑似病料，試驗結(jié)果表明，本研究建立的PRRSVSYBR Green I PCR特異性強，耗時短，操作簡單。劉長龍等為快速檢測PRRSV，針對其N蛋白基因保守序列，設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，以體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)計并改良檢測PRRSV的Taq MAN熒光定量PCR方法。應(yīng)用該方法檢測除豬繁殖與呼吸綜合征病毒以外的豬病病原，結(jié)果均呈陰性；針對PRRSV陽性RNA的測試敏感度可達(dá)到10拷貝，比普通PCR靈敏10～100倍，結(jié)果表明該實驗建立的PRRSV Taq Man熒光定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。

3.3 依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）

NASBA即依賴于核酸序列的擴(kuò)增，是一種擴(kuò)增RNA的新技術(shù)，是由1對引物引導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異核苷酸序列等溫擴(kuò)增的酶促反應(yīng)過程。反應(yīng)在42 ℃進(jìn)行，可在2 h左右將模板RNA擴(kuò)增約109倍，不需特殊的儀器。梁海霞等針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF1中編碼nsp2的基因序列設(shè)計引物，創(chuàng)建了NASBA方法，并聯(lián)合微孔板中液相雜交與酶標(biāo)顯色反應(yīng)檢測NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物，建立了檢測高致病性PRRSV的NASBA-ELISA[15]。瓊脂糖凝膠電泳表明，NASBA方法擴(kuò)增出了特異性核酸陽性條帶。將NASBA產(chǎn)物RNA系列稀釋后同時進(jìn)行了ELISA和Northern雜交。結(jié)果顯示，ELISA和Northern雜交最高可分別檢測到1：50和1：30稀釋的產(chǎn)物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可檢測到101．83TCID50/ Ml的Hun4株P(guān)RRSV。該方法只對3株高致病性PRRSV的檢測結(jié)果為陽性，對經(jīng)典株P(guān)RRSV和其他豬源病毒的檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，NASBAELISA能夠敏感并特異地檢測高致病性PRRSV，預(yù)示NASBA在PRRSV檢測上應(yīng)用前景廣闊。

3.4 原位雜交技術(shù)（ISH）

Suarez等以PRRSVRNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增和地高辛標(biāo)記，制備了ORF7433bP cDNA地高辛探針，對試驗感染豬的肺臟、淋巴結(jié)和腎臟進(jìn)行了原位雜交，檢測到了PRRSVRNA，較免疫組化具有更高的敏感性和特異性。Chueh等[16]通過制備地高辛探針，成功建立了敏感熒光原位雜交技術(shù)，該方法采用原位RNA/RNA雜合體與抗地高辛抗體堿性磷酸酶結(jié)合，再用堅固紅TR鹽/萘酚As-MX磷酸鹽顯色，用顯微鏡觀察，并認(rèn)為該方法結(jié)果明顯、清晰，對PRRS臨床診斷及病毒持續(xù)感染研究有重要意義。

3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

Notomi等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 法（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（65 ℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。張躍偉等建立了熒光顯色在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）檢測PRRSV的方法，該方法使用了針對靶序列M＋N基因的1組引物，并且能在63 ℃等溫條件下30 min內(nèi)完成反應(yīng)[17]。在敏感性檢測中RT-LAMP與RT-PCR都能檢測103個包含靶基因片段的重組質(zhì)粒。結(jié)果說明，應(yīng)用熒光顯色劑的RT-LAMP檢測方法可快速檢測PRRSV。鑫婷等[18]建立了PRRSV RTLAMP檢測方法，試驗結(jié)果表明，RTLAMP檢測方法可快速、靈敏、特異的檢測PRRSV，并適用基層和現(xiàn)場檢測，其他人Rovira等、Chen等也建立了類似的方法。LAMP是一種嶄新的DNA擴(kuò)增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點，具有替代PCR方法的可能性。

3.6 基因芯片檢測技術(shù)

楊林等建立PRRSV基因芯片檢測技術(shù)，其根據(jù)PRRSV的核衣殼蛋白編碼基因序列設(shè)計了1對特異性引物P1/P2，擴(kuò)增出大小為294 bp的目的條帶；再根據(jù)目的片段，設(shè)計合成4條寡核苷酸探針，其中反向引物的5′端用熒光素CY3標(biāo)記[19]。以熒光標(biāo)記不對稱PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，通過將單鏈PCR產(chǎn)物與芯片雜交實現(xiàn)對PRRSV的檢測，建立PRRSV的基因芯片檢測方法。利用該方法對39份豬組織樣品進(jìn)行檢測，表明該方法快速檢測病料組織中PRRSV是可行的，對PRRSV的快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。郭煥成等建立高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒nsp2缺失變異株與經(jīng)典美洲型毒株基因芯片鑒別方法，設(shè)計擴(kuò)增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失區(qū)域的nsp2基因片段的二重PCR引物，并設(shè)計長度為31～35 bp的美洲型毒株通用寡核苷酸探針和非缺失株相對于變異株nsp2基因缺失區(qū)域的探針，建立寡核苷酸芯片方法[20]。檢測了該方法的特異性和靈敏度，并進(jìn)行初步應(yīng)用。結(jié)果通過雜交模式可清楚地區(qū)分經(jīng)典毒株與缺失毒株；芯片探針與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒樣品無非特異性雜交；芯片法與常規(guī)PCR法的靈敏度相近；對12份疑似高致病性PRRS豬樣品的結(jié)果與普通PCR法一致。

由于當(dāng)前PRRS給世界各國生豬養(yǎng)殖帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅了生豬養(yǎng)殖的發(fā)展，采用高效、特異、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)對 PRRS進(jìn)行診斷和控制有著重要的意義。而用于 PRRS檢測的技術(shù)有多種多樣，每一種檢測方法均有其自身的優(yōu)點與不足，現(xiàn)實的生產(chǎn)實踐應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實際檢測需要及實驗條件等情況來選擇相應(yīng)的檢測技術(shù)，從而為該病的診斷和防控措施的制訂提供一定的依據(jù)。本文較詳細(xì)地綜述了目前常用的PRRSV的診斷方法與技術(shù)，不同的技術(shù)方法從不同方面對豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防控提供了便利工具，大大加快了該病的防控步伐。隨著相關(guān)研究在不斷深入，許多新的診斷技術(shù)和方法還會不斷涌現(xiàn)，這些都必將為今后的生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來更好的技術(shù)保障。

[1] 楊漢春． 豬繁殖與呼吸綜合征綜述[J]．豬業(yè)科學(xué)，2006，23 (5)：19-20．

[2]湯德元，趙啟祖，李春燕，等． 貴州省豬繁殖與呼吸綜合征病毒OR F 5基因的變異分析[J]． 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40(8)：1271-1275．

[3] DEWEY C， CHARBONNEAU G， CARMAN S，et al． Lelystadlikestrain of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus(PRRSV) identified in Canadian swine[J]．Can Vet，2000，41(8)：493-494．

[4] YOON K， WU L，ZIMMERMAN J，BENSON J． Field isolates of porcinereproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) varyin their susceptibility to antibody dependent enhancement(ADE) of infection[J]．Vet Microbiol， 1997，55(1)：277-287．

[5] 羅長保，孫穎杰，等．間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測豬生殖與呼吸系統(tǒng)綜合征血清抗體的研究[J]．中國獸醫(yī)雜志，1997(10)：6-7．

[6] 王剛，張鶴曉，甘孟侯，等． IPMA檢測豬生殖和呼吸綜合征病毒抗體的研究[J]．中國獸醫(yī)雜志，1996(12)：3-5．

[7] 仝利劍，趙建增，張社民，等． 豬藍(lán)耳病病毒抗體雙抗原夾心E L ISA方法的建立及初步應(yīng)用[J]． 中國獸醫(yī)學(xué)報，2010(10)：1273-1276．

[8] 譚斌，劉長明，危艷武，等． PRRSVIPMA抗體檢測試劑盒的研制及其應(yīng)用[J]． 中國獸醫(yī)科學(xué)，2006(11)：880-884．

[9] 王 剛 ，張 鶴 曉 ，甘 孟 侯 ，等 ．Dot─E L ISA檢 測 豬 生 殖 和 呼 吸綜合征抗體的研究[J]． 中國獸醫(yī)雜志，1996(10)：3-5．

[10] 王忠，楊漢春，郭鑫，等．重組M蛋白-乳膠凝集試驗檢測PR R S病毒血清抗體的研究[J]．中國獸醫(yī)雜志，2002，38(7)：11-13．

[11] 趙耘，張廣州，秦玉明，等． 套式RTPCR檢測豬繁殖和呼吸綜合征病毒的研究[J]． 微生物學(xué)通報，2003(6)：77-80．

[12] 顧海洋，左文斌，賀艷艷，等． 高致病性藍(lán)耳病毒與低致病性藍(lán)耳病毒RT-PCR檢測方法[J]． 塔里木大學(xué)學(xué)報，2011(1)：20-24．

[13] 楊宗照，母安雄，方維煥． 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光定量PCR方法的建立[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31 (4)：288-291．

[14] 王榮． SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測豬繁殖與呼吸綜合征毒．福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009年學(xué)術(shù)年會論文集[C]．福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會，2009：4．

[15] 梁海霞，薛青紅，高金源，等． 高致病性豬生殖與呼吸綜合征病毒NASBAELISA檢測方法的建立[J]． 中國獸醫(yī)科學(xué)，2009 (5)：401-404．

[16] CHUEH L． A sensitive fluorescence in situ hybridization tech-nique for detection of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus[J]． J Virlo Methods， 1999，79(2)： 133-140．

[17] 張躍偉，李旭妮，郭盼盼，等． 熒光顯色在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的應(yīng)用[J]． 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010，18 (3)：508-513．

[18] 鑫婷，侯紹華，賈紅，等． 豬呼吸與繁殖綜合癥病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J]． 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1)：185-191．

[1 9]楊林，潘全會，曹巧玲，等． 豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒基因芯片檢測技術(shù)的建立與優(yōu)化[J]． 中國動物檢疫，2007，24(5)：25-28．

[20] 郭煥成，席進(jìn)，李江南，等． 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2缺失變異株與經(jīng)典美洲型毒株基因芯片鑒別方法的建立[J]． 中國生物制品學(xué)雜志，2010，23(11)：1254-1259．

2017-05-05）

貴州省2014年農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目資助(黔科合NY字[2014]3055號)

胡玲玲(1993-)，女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)的科研學(xué)習(xí)

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail:tdyuan@163.com