金黃色葡萄球菌小菌落突變株研究進展及其臨床意義

何春燕， 劉慶中

金黃色葡萄球菌小菌落突變株研究進展及其臨床意義

何春燕， 劉慶中

金黃色葡萄球菌； 小菌落突變株； 臨床意義

金黃色葡萄球菌（金葡菌）能夠引起從癥狀輕微的皮膚軟組織感染到威脅生命的膿毒血癥等各種臨床感染。在感染過程中，該菌能夠形成一種特殊的變體——小菌落突變株（small colony variants， SCV）。金葡菌SCV早在100多年前就已報道，20年前因發現其與持續性、復發性難治金葡菌感染相關而受到關注[1]。與正常菌株相比，金葡菌SCV生長緩慢、菌落形態不典型、生化反應不活躍，給臨床實驗室的常規分離和鑒定帶來很大挑戰[2-3]。金葡菌 SCV能適應胞內生存。這種生存方式的改變同時伴隨著細菌代謝的深刻變化，顯著影響病原菌與宿主間的相互作用，結果常導致以SCV感染為特征的慢性難治性感染[1]。另外，胞內生存方式還可保護細菌免受抗菌藥物和宿主防御系統的攻擊，加之SCV自身對一些抗菌藥物敏感性的降低[2]，使得金葡菌SCV感染的危害更為嚴重。當前，金葡菌SCV感染不僅存在于人類，在畜牧獸醫學和食品微生物學領域也有報道[3]。本文就當前研究文獻，對金葡菌SCV的特征、分類、抗菌藥物敏感性、實驗室分離鑒定、形成機制、臨床意義及治療方案等方面綜述如下。

1 金葡菌 SCV特征

金葡菌SCV典型特征是生長代謝緩慢、菌落細小（為正常菌株的1/10左右）、色素合成能力低下、溶血性下降、凝固酶反應遲緩、毒力基因表達下調，與生物膜形成和黏附相關的主要基因常常表達增加[4]。菌落細小多由細菌缺乏甲萘醌（維生素K3）、氯化血紅素和/或胸腺嘧啶核苷等生長因子所致[2]。SCV常常不太穩定，生存于宿主細胞內的SCV可恢復成高毒力、快速生長的正常形態菌株，使宿主細胞裂解導致復發或慢性感染[5]。

2 金葡菌SCV的營養缺陷分類

盡管細菌代謝途徑中的很多變化都可以導致緩慢生長，但目前為止，臨床上已發現并能明確具體營養缺陷類型的SCV主要是電子傳遞鏈缺陷型（血紅素和甲萘醌缺陷型）、胸腺嘧啶合成缺陷型和CO2依賴型。

2.1 電子傳遞鏈缺陷型

功能性或遺傳性甲萘醌和氯化血紅素合成缺陷導致電子傳遞鏈缺陷，進而ATP合成顯著降低，從而形成SCV表型。以往臨床報道的此種類型SCV常分離自氨基糖苷類抗菌藥物治療的患者，它們可以通過補充甲萘醌或血紅素回復至親本株表型。幾個基因的突變與電子傳遞鏈缺陷型SCV形成密切相關。hemB（編碼膽色素原合酶）和menD [編碼2-琥珀酰-6-羥基-24-環巳二烯-1-甲酸（SHCHC）合成酶]突變可阻斷甲萘醌和血紅素的生物合成；ctaA突變可阻斷血紅素A（HemA，與細胞色素生物合成相關）的生物合成，進而影響細胞色素的合成。電子傳遞鏈缺陷型SCV在代謝上的主要特征為三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA循環）減弱或缺乏。研究顯示，在這類SCV菌株中主要是acnA基因（編碼順烏頭酸酶）表達降低，導致TCA循環途徑碳通量減少[1，6-7]。電子傳遞鏈缺陷型SCV另一特點是不表達金葡菌附屬基因調節子（accessory gene regulator，agr）的效應分子RNA III[1，7]。另外，金葡菌SCV和其親本株的cDNA文庫數據顯示，表型特異的非編碼蛋白RNA（non-proteinencoding RNA，npcRNA）的表達可能也在SCV的形成中發揮作用[8]。

2.2 胸腺嘧啶脫氧核苷（TD）合成缺陷型

2.3 依賴型SCVCO2

CO2依賴型SCV可分離自不同感染的患者（如手術傷口感染、醫療裝置相關感染、皮膚軟組織感染等）[10]，當其處于5% CO2環境中時又可恢復為正常形態的菌株。但是目前有關金葡菌CO2依賴型SCV的形成機制及代謝上的變化還是空白。

另外，臨床上還分離到一些目前仍不能確定具體營養缺陷類型的SCV，其機制可能涉及呼吸鏈的其他環節障礙導致SCV表型產生。

3 影響金葡菌SCV形成的其他因素

雖然在感染進程中，金葡菌能夠自發形成SCV表型[11]，但臨床上分離的金葡菌SCV主要還是與抗菌藥物的長期使用有關。隨著研究的深入，發現越來越多的體內外因素與SCV形成密切相關。

3.1 喹諾酮類藥物

體外用亞抑菌濃度喹諾酮類藥物作用金葡菌24 h后出現SCV和正常菌株的混合表型。該種SCV在補充氯化血紅素、甲萘醌或胸腺嘧啶脫氧核苷后仍不能回復為正常形態的親本菌株，表明其不是傳統概念上的SCV（電子傳遞鏈缺陷型或胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型）。此種SCV形成的機制可能是影響ATP生成的其他途徑（如TCA循環酶）相關基因發生突變所致[12]。

3.2 三氯生

三氯生是一種人工合成的雙酚類消毒劑，作為抗菌添加劑廣泛應用于健康衛生保健領域。研究顯示，亞致死劑量的三氯生能夠誘導金葡菌形成非氯化血紅素、甲萘醌或胸腺嘧啶脫氧核苷缺陷型的SCV表型，推測細胞壁形成缺陷可能是其產生機制[13]。

3.3 銅綠假單胞菌（共生細菌）

金葡菌與銅綠假單胞菌共同生長時，后者的胞外產物4-羥基-2-庚基喹啉氮氧化合物（HQNO）會對金葡菌的呼吸產生抑制效應，繼而導致金葡菌SCV的產生。一種名為多重耐藥-ABC轉運蛋白通透酶（multidrug resistant-ABC transporter permease）的蛋白可能參與了SCV的形成。這種通透酶通過將外源性分子排出胞外以減少后者對細菌的損傷作用。金葡菌與銅綠假單胞菌共培養時，能夠上調并大量表達多重耐藥-ABC轉運蛋白通透酶的金葡菌存活下來并表現為SCV表型[1，14]。

4 調節金葡菌SCV形成的分子

4.1 agr群感系統

agr（accessory gene regulator system，附屬基因調節系統）是金葡菌上調胞外毒素和胞外酶表達的重要雙組份系統。在感染急性期，agr系統過表達，進而上調毒力因子的表達，使得細菌能夠對抗免疫細胞攻擊、破壞侵入組織，并進一步在深部組織建立感染。侵入宿主細胞后，細菌agr系統表達下調，使得細菌獲得長期生存和形成SCV的能力[15]。

4.2 SigB

SigB（sigma factor B）是應激相關的轉錄因子，有助于細菌應對各種不利的壓力條件。研究表明，sigB基因缺失株不具有形成SCV的能力，而在一些特殊環境下，如金葡菌與銅綠假單胞菌共存時，后者的胞外產物就能激活前者的SigB，抑制其呼吸作用，從而誘導金葡菌SCV形成；另外，在慢性感染過程中SigB促進生物膜形成和黏附素的表達。由此認為，SigB與細菌胞內長期生存和SCV動態形成具有重要相關性[1，15]。

4.3 RelA水解酶

Gao等[16]報道了一種金葡菌SCV形成的新機制。該菌株relA基因上的1個核苷酸突變導致RelA水解酶活性降低，從而給細菌造成了長期的與SCV形成相關的嚴苛應激條件。

4.4 活性氧

亞致死濃度過氧化氫產生的活性氧自由基能夠抑制金葡菌增殖，誘導編碼菌株DNA修復系統RexAB、重組酶A和多聚酶V蛋白的基因發生突變，進而導致慶大霉素耐藥SCV的形成[17]。

4.5 陽離子蛋白

金葡菌進入胞內后被吞噬形成吞噬體，吞噬體內的酸性環境可以誘導SCV形成[18]，由于宿主胞內主要是陽離子環境，故而推測可能是胞內的陽離子蛋白對SCV進行了選擇。不過，目前并不清楚具體的物質類型，有待進一步探究。

5 臨床意義

金葡菌感染的一個顯著特征是即使進行了正確適當的抗菌藥物治療，感染也會轉為慢性或經常復發，這一現象與其形成SCV密切相關。因為SCV表型菌株毒力減弱，易于在宿主細胞內生存從而逃避免疫系統攻擊和抗菌藥物作用[4]。即使沒有任何選擇性壓力存在，金葡菌在連續的復制分裂過程中也可形成SCV[11]，但未見有其SCV分離自急性感染的報道。

據文獻報道，氨基糖苷類治療金葡菌感染易于形成電子傳遞鏈缺陷型SCV，而甲氧芐啶-磺胺甲唑治療則與TD-SCV的形成密切相關[1，19]。Tuchscherr等[20]研究顯示，莫西沙星和克林霉素也能促進SCV的形成。不過，當前仍有許多SCV的形成與抗菌藥物治療間關系不明。

金葡菌SCV可分離于多種類型的臨床標本，表明其與多種感染相關。目前，各有1例金葡菌SCV引起的起搏器相關感染和人工心臟瓣膜感染性心內膜炎的報道[1，21]。有3項研究報道了金葡菌SCV導致的持續性、復發性人工關節感染[1]。Sendi等[22]和Tande等[23]報道分別有6.0%（5/83）和33.6%（38/113）的人工關節感染與金葡菌SCV有關。金葡菌SCV與皮膚、黏膜、軟組織和傷口等的慢性感染也有一定的關系[1]。Tan等[24]和Kim等[25]在慢性鼻竇炎組織標本中也分離出黏膜內金葡菌SCV。此外，已有金葡菌SCV分離自Darier病（毛囊角化病）的皮膚感染標本[1]。不過，金葡菌SCV還是最常分離自囊性纖維化（cystic fi brosis）患者的氣道感染標本。囊性纖維化是一種先天性遺傳性疾病，主要發病于歐美國家的白種人，患者多死于慢性細菌感染導致的呼吸衰竭。囊性纖維化患者的氣道具有一種獨特的環境，如中性粒細胞聚集、缺氧、共感染細菌間的競爭及抗菌藥物的選擇壓力等，在這種情況下細菌易于形成各種適應形式，如形成SCV[1]。此外，在乳腺導管閉鎖導致的乳腺膿腫及2型糖尿病病足中也有分離到金葡菌SCV的報道[26-27]。

6 實驗室診斷

金葡菌SCV不典型的生理、代謝和形態特征給常規的實驗室檢測帶來挑戰。及時、正確的分離鑒定SCV在臨床上具有重要意義，一是可以提示慢性感染的存在，二是為制定針對性的治療方案提供依據。因此，為了正確分離鑒定出金葡菌SCV應該遵循以下原則。

6.1 臨床標本

組織樣本優于拭子，并立即送至實驗室培養，確保SCV得以正確培養并避免因細胞崩裂SCV從胞內釋放而發生表型轉換復原。對非囊性纖維化相關感染，標本質量至關重要，如關節抽出液、術中留取的組織標本、活檢標本或液體標本最佳，盡量避免采用拭子采樣送檢；對醫療裝置或骨樣本，超聲處理能夠提高SCV培養的陽性率。對囊性纖維化感染，除了常用的痰液外，深部喉拭子也可用于SCV培養[1]。

6.2 培養和鑒定

金葡菌SCV的特性給臨床檢測帶來不少困難，常常被忽視或錯誤鑒定。SCV菌株的分裂時間大約是正常形態菌株的6倍，在固體培養基上需要培養24 h以上（大多要48～72 h）才能長成肉眼可見的菌落。血平皿上培養24 h，對于針尖樣大小[正常菌落大小（1～3 mm）的1/10左右］、無或減少的金黃色色素（白色菌落）、無或減少的β溶血現象的菌落應高度懷疑為SCV。對于TDSCV還會出現邊緣半透明中間色素偏深的“油煎蛋”樣菌落。由于金葡菌SCV菌落形態容易與生長緩慢的棒狀桿菌、無溶血現象的鏈球菌或凝固酶陰性葡萄球菌混淆，需注意鑒別。尤其是SCV與形態正常的親本菌株混合存在時更容易認為是雜菌而被忽視[1]。另外，在金葡菌選擇或顯色培養基上，大多數SCV不發生顏色變化。

SCV為厭氧代謝，TCA循環途徑碳通量減少，加之生長緩慢，導致其生化反應減弱或缺乏，致使一些經典的鑒定反應如發酵、氧化及多種底物分解不能正常發生，從而發生菌株的錯誤鑒定甚至是不能鑒定，即使是現代的微生物鑒定系統也是如此。另外，觸酶、凝固酶試驗及其他用于初步鑒定的試驗也會陽性時間延遲甚或陰性。所以基于生化反應方法鑒定金葡菌SCV的結果非常不可靠。種特異性聚合酶鏈反應（PCR）檢測和種系標志性基因測序對于鑒定SCV是一個比較好的方法，如16S rRNA或rpoB基因測序，nuc、clfA、eap、coa和sodM等基因的PCR檢測都可以用于金葡菌SCV的鑒定[1]。隨著質譜技術在臨床微生物學中的應用，也是鑒定金葡菌SCV的可靠方法[1]。

7 抗菌藥物敏感性試驗

由于SCV生理和代謝上的特點，影響常規藥敏試驗檢測方法的培養時間和細菌密度都會發生改變，因此檢測SCV菌株的抗菌藥物敏感性比較困難。對MIC的解釋應當十分謹慎。某些特殊菌株其SCV和親本菌株的MIC值一致，但藥效學研究顯示藥物的抗SCV效果卻顯著下降[2]。對于金葡菌SCV菌株甲氧西林耐藥性的檢測，PCR擴增mecA、mecC基因或膠乳凝集法檢測PBP2a比較可靠。能為SCV抗菌藥物敏感性提供指導作用的是瓊脂稀釋法或E試驗。藥敏檢測時平皿需放置5% CO2培養箱2～3 d[2]。即使如此也要注意結果的判讀，因為對某些藥物很難獲得清晰可靠的藥敏結果[1-2]。

8 金葡菌SCV耐藥性

對于SCV的耐藥性目前尚無大樣本量的流行病學調查研究。零星的報道顯示，SCV菌株對大多數抗菌藥物的MIC與其正常表型的親代菌株類似。但由于導致缺陷機制的原因，氨基糖苷類和抗葉酸類抗菌藥物分別在電子傳遞鏈缺陷型和胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SCV中幾乎全部喪失活性[2]。某些菌株的SCV和親本菌株MIC相比較雖然沒有差別，但藥效學研究顯示抗菌藥物的抗SCV效果顯著下降，如達托霉素（需高濃度延長治療時間才能起到殺菌作用）、萬古霉素和β內酰胺類（抗電子傳遞鏈缺陷型SCV效果減弱）[2]。喹諾酮類藥物對電子傳遞鏈缺陷型和胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SCV高度有效，而慶大霉素只對胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SCV發揮作用[2]。

9 金葡菌SCV相關感染的治療

目前，臨床上仍無葡萄球菌SCV感染的最佳治療方案。但根據SCV菌株的特點有以下因素需要考慮：①根據營養缺陷類型判斷SCV的總體耐藥特性；②宿主細胞內的定位；③親本菌株和/或SCV菌株的藥敏試驗結果；④感染部位的藥效學特點。由于SCV菌株常與親本菌株共同出現或是可回復為正常表型菌株，在治療時抗菌藥物的使用應該覆蓋2種表型的菌株。理想的抗SCV菌株的治療方案應該包括能夠穿透宿主細胞，并具有抗這種緩慢生長表型的抗菌藥物。在臨床實踐中，經常將利福平或氟喹諾酮類聯合其他種類抗菌藥物治療SCV感染，這種聯合治療對清除胞內SCV非常有效[1]。對于青霉素耐藥甲氧西林敏感金葡菌SCV感染，可用耐酶β內酰胺類青霉素或第一、二代頭孢菌素治療。對青霉素敏感SCV感染，青霉素就可用于治療。而對青霉素敏感性不確定的SCV，在選用青霉素治療的同時，可增添β內酰胺酶抑制劑類抗菌藥物。對于甲氧西林耐藥金葡菌（MRSA）SCV感染，則可用萬古霉素治療，持續嚴重感染者需用糖肽類抗菌藥物聯合方案或其他抗MRSA活性的抗菌藥物治療（對SCV，萬古霉素不是殺菌劑）[1]。

10 展望

SCV是一種異質性很大的細菌群體，其形成機制多樣、毒力及耐藥水平各異、實驗室檢測困難。在感染期間，不同的SCV形成機制以時間依賴性方式發揮作用。感染早期，細菌借助其對環境變化適應性的調節機制快速形成SCV。通過這種方式，病原菌能夠侵入宿主細胞，從而逃避免疫系統攻擊及抗菌藥物的殺傷作用。如果宿主免疫機制和抗菌藥物不能有效清除細菌，根據感染類型和抗菌藥物的選擇性壓力，細菌可以在電子傳遞鏈系統或嘧啶合成上進一步發生突變，形成持久的SCV。所以，為了有效地治療SCV感染，如何提高實驗室診斷（如鑒定、藥敏）技術水平及探索出既能清除SCV又能防止產生SCV的治療方案是一個有待深入研究的領域。目前，我們正在探索模擬臨床抗感染用藥，利用臨床菌株誘導獲得穩定金葡菌SCV表型的方法，當下已獲得甲氧芐啶-磺胺甲唑藥物誘導產生的穩定型金葡菌SCV，繼而對其進行包括基因水平、轉錄水平以及蛋白質水平的研究，從而為發展更為有效的SCV鑒定及治療方法探索新思路、新靶點。

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