黏膜相關恒定T細胞水平在膿毒癥患者中的臨床意義

毛玉林， 陸珠鳳， 黃俊峰， 冒海蕾， 張 穎， 張曉明， 諸杜明

黏膜相關恒定T細胞水平在膿毒癥患者中的臨床意義

毛玉林1， 陸珠鳳1， 黃俊峰1， 冒海蕾1， 張 穎2， 張曉明2， 諸杜明1

目的 研究膿毒癥患者外周血循環黏膜相關恒定T細胞（MAIT細胞）的數量及活化狀態。方法 使用流式細胞技術測定外周血MAIT細胞的數量、比例和CD69活化分子的表達。結果 膿毒癥患者在疾病早期外周血MAIT細胞數量顯著下降；在入住ICU的第1天與第3天，膿毒癥組患者MAIT細胞的CD69表達量維持在較高水平。結論 嚴重感染為特征的患者外周血MAIT細胞數量顯著減少提示可能會發生膿毒癥。

黏膜相關恒定T細胞； 膿毒癥； 抗感染免疫； 預后

在2016年的《膿毒癥和膿毒癥休克第三次國際共識定義（sepsis-3）》中，膿毒癥被定義為感染引起宿主調節紊亂而導致的威脅生命的臟器功能障礙[1]。在膿毒癥的發病過程中，機體免疫系統會出現不同程度的缺陷，促炎因子與抗炎因子比例失調，固有免疫細胞持續激活，效應細胞數量缺少或功能障礙，抑制性免疫細胞的功能活動相對增強，導致機體不能產生有效的清除病原體的免疫活動，但造成這種免疫紊亂的根源目前仍不清楚[2]。

有學者認為，固有免疫反應紊亂可能是膿毒癥的主要決定因素[3]。黏膜相關恒定T細胞（mucosal-associated invariant T cells，MAIT細胞）是一群進化保守的固有樣T淋巴細胞，此類細胞因其嗜組織性，傾向于分布在腸道黏膜固有層而得名[4]。其實，除了黏膜組織，MAIT細胞在肝臟、外周血中的含量也相當豐富[5]。近年來發現，MAIT細胞與B族維生素代謝產物有關[6]，在炎癥早期可識別多種細菌、真菌并啟動自身活化，分泌炎性反應細胞因子，殺傷病原微生物，并構建起銜接固有免疫和適應性免疫的橋梁[7-8]。目前，對MAIT細胞與感染性疾病的研究，主要集中在結核病、肺炎、AIDS、肝炎等疾病[9]，Grimaldi等[3]發現重癥膿毒癥患者外周血MAIT細胞頻數明顯減少，但國內外文獻關于MAIT細胞在膿毒癥中作用的報道較少。本研究旨在通過研究膿毒癥患者外周血循環MAIT細胞的改變來探索早期預測膿毒癥發生發展的方法，從免疫微環境的角度為臨床疾病的診斷提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例選擇 選擇2015年8月－2016年8月在復旦大學附屬中山醫院就診的外科患者36例，平均年齡（68.5±9.4）歲，其中男28例，女8例。患者中因感染性疾病手術術后合并發生膿毒癥22例，設為術后膿毒癥組（S組）；非感染性疾病手術正常康復患者14例，設為術后正常恢復組（F組）。另選取13例正常健康人，設為健康對照組（N組）。S組患者均符合2016年美國胸科醫師學院（ACCP） / 美國危重病醫學會（SCCM）共識會議制定的Sepsis 3.0所列診斷標準：感染所致的序貫性臟器功能衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）評分≥2可診斷膿毒癥；膿毒癥休克是膿毒癥中較嚴重的一種類型，即經過充分的液體復蘇，患者仍需要升壓藥來維持，平均動脈壓（MAP）＞65 mmHg，同時血清乳酸水平＞2 mmol / L。

1.1.2 排除標準 先天性或獲得性免疫功能缺陷；存在心、肝、腎等慢性器質性病變；自身免疫性疾病（病毒性肝炎、HIV感染等）；精神疾病；入院前3個月內使用過皮質類固醇或其他免疫抑制劑。

1.1.3 病情危重程度及預后評估方法 ① SOFA評分；②急性生理和慢性健康評分（APACHE II評分）。

1.1.4 倫理審批及知情同意 本研究已提呈復旦大學附屬中山醫院倫理委員會并通過審批，課題開展前向家屬及意識清醒患者告知研究目的和方法并取得知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集外周血，每次5 mL。所得血樣2 h內即行血細胞計數并提取外周血單個核細胞（PBMC）。

1.2.2 采血時間 S組患者于術后確定膿毒癥診斷的24 h內和第3天動態采集血樣，F組患者術后第1個24 h內抽取血樣，N組為健康體檢時采集血樣。

1.2.3 PBMC 染色所用抗體及熒光通道，見表1。

表1 流式細胞染色所用抗體Table 1 Antibodies used in f l ow cytometry

1.2.4 實驗方法 將上述抗體進行滴定后按適當比例混合成抗體混合物（mixture），每（1～2）×106PBMC中加入50 μL混合抗體，避光，常溫染色15 min，洗滌后2 %甲醛固定，LSR Fortessa流式細胞儀檢測，S組最后入組的6例患者和N組、F組患者同時測定T細胞CD69表達量。實驗步驟參照廠家實驗操作指南進行。

1.2.5 數據分析 流式細胞儀所獲得數據用FlowJo V9.3.2進行調節補償并數據分析。

1.2.6 統計學方法 數據資料用SPSS 22.0軟件進行統計學處理，組間比較采用各組第1次取樣數據。數據采用均數±標準差（x±s）或中位數（四分位數間距P25，P75）表示，符合正態分布、方差齊性的兩組數據比較采用獨立樣本T檢驗，三組數據間比較采用單因素方差分析；不符合正態分布的三組數據比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whutney U秩和檢驗；S組第1天與第3天的配對數據采用Wilcoxon檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組病例基本情況

三組病例入組年齡無統計學差異。S組并發膿毒癥的病因為消化道穿孔16例、化膿性膽管炎6例。患者病情危重程度和預后采用SOFA評分和APACHE II評分。S組APACHE II評分明顯高于F組患者評分，P＜0.05，差異有統計學意義。見表2。

2.2各組病例血常規絕對值和相對值比較

S組和F組患者外周血中性粒細胞數量均高于N組，差異有顯著統計學意義。而S組患者外周血淋巴細胞數量明顯少于F組和N組。S組和N組患者單核細胞數量差異無統計學意義。見表3。

表2 各組病例一般資料Table 2 General data of patients compared between groups

表3 各組血樣血細胞計數Table 3 Blood cell counts compared between groups[mean ± SD or median （P25， P75）]

2.3 MAIT細胞絕對值和相對值的分析

圖1 MAIT 細胞的流式分析途徑Figure 1 Strategy for f l ow cytometric analysis of mucosal associated invariant T （MAIT） cells

MAIT 細胞絕對計數S組對F組、F組對N組，P＜0.01，差異有統計學意義；S組對N組，P＜0.001，差異有顯著統計學意義。

MAIT細胞在T細胞中所占百分比S組對N組，P＜0.01， S組明顯降低，差異有顯著統計學意義；F組對N組、S組對F組，P＞0.05，差異無統計學意義，見圖2。

2.3.2 S組組內數據分析 與第1天基線值相比，S組患者第3天的MAIT絕對數和MAIT細胞占T細胞百分比有輕度升高，但差異無統計學意義，見圖3。

2.4 MAIT 細胞活化狀態分析

2.4.1 活化MAIT細胞比例分析 CD69是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，又稱活化誘導分子，體內外T淋巴細胞活化均可激活CD69，它是T淋巴細胞活化最早表達的膜表面分子。

CD69+MAIT細胞在總MAIT細胞相對占比分析：S組對N組，P＜0.001，S組表達量明顯增高，差異有顯著統計學意義；S組對F組、F組對N組，P＜0.01，差異有顯著統計學意義。

CD69+CD3+CD4-非MAIT（Non-MAIT）細胞占總CD3+CD4-non-MAIT細胞相對值分析：S組對N組，P＜0.05，差異有統計學意義。見圖4。

在CD3+CD4+T細胞群中，CD69表達量在各組差異無統計學意義。

2.4.2 S組組內活化MAIT細胞的動態變化 選取6例S組患者在確診后1 d和3 d對MAIT細胞活化指標進行了動態觀察，發現S組患者在確診的第1天與第3天MAIT細胞持續高表達CD69，見圖5。

圖2 三組患者外周血 MAIT 細胞百分比與絕對數比較Figure 2 The number and percentage of circulating mucosal associated invariant T （MAIT） cells compared between three groups

圖3 S 組患者第1天與第3天外周血 MAIT 細胞百分比與絕對數比較Figure 3 The number and percentage of circulating mucosal associated invariant T （MAIT） cells on day 1 and day 3 in patients with sepsis

2.5 MAIT細胞數量與預后的關系

在三組病例中，最后S組出現了4例死亡，病死率18.18 %。死亡組患者MAIT細胞數量及百分比與存活組的數據相比，差異無統計學意義。F組和N組未出現隨訪期間（28 d內）死亡。

3 討論

MAIT細胞是一群在進化上高度保守的T淋巴細胞，它有一條相對固定的T細胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）α鏈并被Ⅰb型主要組織相容性復合體相關分子（major histocompatibility complex class Ib molecule，MHC class I-related protein 1，MR1）限制[5]。在血循環中，MAIT細胞占總T細胞的1 %～10 %，但由于其具有能識別細菌來源的B族維生素代謝產物而觸發激活，表達IFN-γ、TNF-α、顆粒酶（granzyme）、穿孔素（perforin）等殺傷性細胞因子，構建固有免疫屏障的防線而引起關注[10]。隨著進一步研究，科學家們還發現MAIT細胞還能分泌IL-2、IL-17等細胞因子，和B細胞有互相作用，是溝通固有免疫和適應性免疫應答之間的橋梁[11]。MAIT細胞富集于肝臟、腸道、呼吸道黏膜等器官組織，與其高表達及遷移相關的趨化因子受體有關。

本研究發現在膿毒癥患者中，循環MAIT細胞數量明顯減少，其絕對值和占總T細胞相對值都出現統計學意義的下降，兩者之中下降比例以相對值下降為更甚，表明發生嚴重感染時，MAIT細胞亞群在T細胞參與抗炎免疫時，群體數量不足。本研究的發現與國外對干燥綜合征、急性膽囊炎、斑疹傷寒、肝炎、結核、銅綠假單胞菌感染、炎性腸病、紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等的研究發現類似，MAIT細胞表達量下降常預示疾病的嚴重狀態[12-13]。

圖4 三組患者 T 細胞各亞型表達 CD69 百分比Figure 4 The expression of CD69 on different T cell subsets compared between three groups

圖5 膿毒癥患者 CD69+MAIT細胞百分比及其絕對數Figure 5 The percentage and number of CD69+mucosal associated invariant T （MAIT） cells in septic patients

CD69是淋巴細胞的一個極早期活化分子，正常人外周血T淋巴細胞很少表達，但遭受抗原刺激1～2 h之內，就可迅速表達CD69。有研究發現，CD69可以通過誘導胞內轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）的產生發揮負向免疫調節作用[14]，并且，CD69是Treg細胞（regulatory T cells）發揮調節性抑制功能的一個重要受體[15]。我們發現，相比N組，F組和S組患者外周血循環MAIT細胞的CD69表達量依次逐漸升高，從另一個方面反映了三組人群的免疫狀態。在嚴重感染早期CD69+MAIT細胞的比例顯著升高，S組與同期F組和N組均存在顯著統計學差異，表明這可能是一個反映疾病嚴重狀態的重要信號。

本研究發現，患者的外周血循環MAIT細胞數量顯著減少，提示患者可能易發生膿毒癥。由于MAIT細胞具有調節炎癥微環境、分泌細胞因子直接殺傷感染細胞、加強適應性免疫應答的作用，MAIT細胞可能是有效控制炎性感染的診斷和治療靶點之一。MAIT細胞發現的時間并不長，該群細胞的功能、調控機制、上下游信號通路還有很多未知。本研究是我們對膿毒癥患者的一個探索性研究，由于樣本量較少，MAIT細胞數量的變化趨勢與患者預后的關系并不明朗，有待通過大樣本驗證，進一步評價MAIT細胞相關指標的臨床意義。

[1] SINGER M， DEUTSCHMAN CS， SEYMOUR CW， et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock （Sepsis-3）[J]. JAMA， 2016，315（8）：801-810.

[2] STEARNS-KUROSAWA DJ， OSUCHOWSKI MF，VALENTINE C， et al. The pathogenesis of sepsis[J]. Ann Rev Pathol， 2011，6（1）：19-48.

[3] GRIMALDI D， LE BOURHIS L， SAUNEUF B， et al. Specif i c MAIT cell behaviour among innate-like T lymphocytes in critically ill patients with severe infections[J]. Intensive Care Med， 2014，40（2）：192-201.

[4] TREINER E， DUBAN L， BAHRAM S， et al. Selection of evolutionarily conserved mucosal-associated invariant T cells by MR1[J]. Nature， 2003，422（6928）：164-169.

[5] MARTIN E， TREINER E， DUBAN L， et al. Stepwise development of MAIT cells in mouse and human[J]. PLoS Biol，2009，7（3）：e54.

[6] KJER-NIELSEN L， PATEL O， CORBETT AJ， et al. MR1 presents microbial vitamin B metabolites to MAIT cells[J]. Nature， 2012, 491(7426): 717-723.

[7] SZABO PA， ANANTHA RV， SHALER CR， et al. CD1d- and MR1-restricted T cells in sepsis[J]. Front Immunol， 2015，6：401.

[8] NAPIER RJ， ADAMS EJ， GOLD MC， et al. The role of mucosal associated invariant T cells in antimicrobial immunity[J]. Front Immunol， 2015，6：344.

[9] WONG EB， NDUNG'U T， KASPROWICZ VO. The role of mucosal-associated invariant T cells in infectious diseases[J]. Immunology， 2017，150（1）：45-54.

[10] KURIOKA A， USSHER JE， COSGROVE C， et al. MAIT cells are licensed through granzyme exchange to kill bacterially sensitized targets[J]. Mucosal Immunol， 2014，8（2）：429-440.

[11] DUSSEAUX M， MARTIN E， SERRIARI N， et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant， tissue-targeted， CD161hi IL-17-secreting T cells[J]. Blood， 2011，117（4）：1250-1259.

[12] LEEANSYAH E， GANESH A， QUIGLEY MF， et al. Activation， exhaustion， and persistent decline of the antimicrobial MR1-restricted MAIT-cell population in chronic HIV-1 infection[J]. Blood， 2013，121（7）：1124-1135.

[13] WANG JJ， MACARDLE C， WEEDON H， et al. Mucosalassociated invariant T cells are reduced and functionally immature in the peripheral blood of primary Sjogren's syndrome patients[J]. Eur J Immunol， 2016，46（10）：2444-2453.

[14] ZHANG X， JIANG Z， GU Y， et al. Inflammation-induced CD69+ Kupffer cell feedback inhibits T cell proliferation via membrane-bound TGF-beta1[J]. Sci China Life Sci， 2016，59（12）：1259-1269.

[15] CORTES JR， SANCHEZ-DIAZ R， BOVOLENTA ER， et al. Maintenance of immune tolerance by Foxp3+ regulatory T cells requires CD69 expression[J]. J Autoimmun， 2014，55：51-62.

Clinical implications of circulating mucosal associated invariant T (MAIT) cells in septic patients

MAO Yulin, LU Zhufeng, HUANG Junfeng, MAO Hailei, ZHANG Ying, ZHANG Xiaoming, ZHU Duming. （Department of Critical Care Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China）

Objective To investigate the number and activation status of circulating mucosal associated invariant T (MAIT) cells in patients with sepsis. Methods Flow cytometric method was used to determine the number and percentage of MAIT cells and their expression of activation molecule CD69. Results The circulating MAIT cells dropped signif i cantly at early stage of sepsis in septic patients. The MAIT cells in the sepsis group continued to express high levels of CD69 on day 1 and day 3 after admission to ICU. Conclusions Remarkable decrease of circulating MAIT cells may portend the possibility of sepsis in patients with severe infection.

mucosal associated invariant T cells; sepsis; anti-inf l ammatory immune response; prognosis

R631.2

A

1009-7708 ( 2017 ) 04-0376-06

10.16718/j.1009-7708.2017.04.006

2017-02-28

2017-04-20

國家自然科學基金（31470879）；復旦大學附屬中山醫院青年基金（2016ZSQN20）。

1. 復旦大學附屬中山醫院重癥醫學科，上海 200032；2. 中國科學院上海巴斯德研究所。

毛玉林（1988—），男，碩士研究生，住院醫師，主要從事膿毒癥細胞免疫學方面的研究。

諸杜明，E-mail：duming_zhu@163.com。