替加環素耐藥機制的研究現狀

王 健， 沈繼錄

·綜述·

替加環素耐藥機制的研究現狀

王 健， 沈繼錄

替加環素； 耐藥機制； 外排系統； 雙組分系統； 細胞膜

替加環素（TGC）是FDA批準的用于治療復雜性皮膚和軟組織感染、復雜性腹腔感染和社區相關細菌性肺炎的抗生素。隨著應用越來越廣泛，替加環素產生耐藥性不可避免。替加環素是一種新型甘氨酰環素類抗菌藥物，全稱為9-叔丁基甘氨酰氨基米諾環素，是繼多西環素、米諾環素、美他環素后開發的新一代四環素類衍生抗生素。該藥通過可逆地結合于16S rRNA，阻斷tRNA進入A位點，抑制了翻譯過程。替加環素與核糖體的親和力高于其他四環素類抗生素20倍[1]。同時，替加環素克服了四環素的耐藥機制，如核糖體保護蛋白（tetM、tetO等）和外排泵（tetK、tetA等）[2]，使得替加環素對四環素和米諾環素耐藥菌均有作用。本文通過介紹替加環素耐藥性機制，我們可以更加主動地確定相關基因的轉移并通過當前的新型“反突變”藥物前瞻性的阻止耐藥性的產生。

1 主動外排系統

1.1 耐藥結節化細胞分化家族（resistance nodulation cell division, RND）

1.1.1 AdeABC外排泵 AdeABC是第1個在替加環素耐藥的鮑曼不動桿菌中發現的RND型外排泵，是由AdeA、AdeB和AdeC 組成的三聯體，其中AdeA是膜融合蛋白，AdeB是外排蛋白，AdeC是外膜通道蛋白。AdeB從細胞內膜或細胞質中攝取底物，通過AdeC轉運到細胞外[3]，在此過程中，AdeA起協調作用，它可使細菌細胞內膜與細胞外膜接近，并能穩定外膜蛋白的結構。編碼泵蛋白的adeABC基因無論在敏感或耐藥株中均普遍存在，與耐藥株的高表達相比，敏感菌株的表達卻很低[4]，提示其可能是細菌產生獲得性耐藥的原因之一。

1.1.2 AdeIJK外排泵 在鮑曼不動桿菌的細胞膜上還存在AdeIJK外排泵。AdeIJK外排泵由膜融合蛋白 AdeI、內膜轉運蛋白AdeJ和外膜蛋白AdeK共同組成。AdeN可抑制AdeIJK外排泵表達，adeN基因位于adeIJK基因的上游，adeN可編碼TetR轉錄調節因子，Rosenfeld等[5]發現BM4587臨床菌株adeN的失活可導致AdeIJK的作用底物即抗生素敏感性降低以及adeJ表達上升5倍。AdeIJK外排泵與 AdeABC 外排泵的結構及功能相似，底物也相似，且AdeIJK與AdeABC對替加環素的外排具有協同作用。

1.1.3 AdeFGH外排泵 AdeFGH也可導致鮑曼不動桿菌對替加環素耐藥。AdeIJK外排泵受adeL操縱子的調節，adeL操縱子位于adeFGH基因的上游，與adeFGH基因呈反向表達，adeL突變可導致 AdeFGH外排泵的過度表達，從而導致細菌耐藥[6]。

1.1.4 AcrAB 外排泵 研究發現AcrAB 外排泵的高表達可導致肺炎克雷伯菌對替加環素耐藥[7]。AcrAB 外排泵具有典型RND家族結構特征，包括3個組成部分：內膜轉運蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白。AraC家族的正轉錄調節蛋白RamA、MarA、SoxS和RarA 可激活外排泵而參與對替加環素耐藥[8-9]，ramR、marR、soxR編碼產物分別是RamA、 MarA、SoxS的阻遏蛋白。Wang等[10]也發現RamA是AcrAB泵的正調節蛋白，它可以導致AcrAB泵產生過度，進而引發耐藥，而RamA可受RamB阻遏，RamA的過表達與RamR的低表達可導致沙門菌對替加環素的耐藥率上升4倍[11]。acrAB操縱子受到阻遏蛋白AcrR調控，AcrR編碼基因的突變也可能與替加環素耐藥相關。

1.1.5 AcrEF 外排泵 在大腸埃希菌的細胞膜上還發現了AcrEF外排泵，它與AcrAB-TolC外排泵有高度的同源性并有相似的底物，其中也包括了替加環素[12]。

1.1.6 OqxAB外排泵 OqxAB外排泵是第1個被發現的由質粒介導的RND家族外排泵。OqxAB外排泵中OqxA是膜融合蛋白，OqxB是內膜轉運蛋白，OqxAB外排泵可能通過其他非特異性的外膜蛋白排出底物[13]。編碼OqxAB的質粒可較容易地水平傳遞到其他腸道菌，如沙門菌和產氣腸桿菌。另外，肺炎克雷伯菌中發現RarA蛋白是OqxAB外排泵的正轉錄調節蛋白，RarA的高表達可導致低水平的替加環素耐藥[9]。

1.1.7 SdeXY外排泵 對于黏質沙雷菌，內源性的RND型外排泵SdeXY與替加環素耐藥相關。Hornsey等[14]研究發現，SdeXY外排泵可導致黏質沙雷菌對替加環素耐藥，SdeXY 泵失活后可恢復細菌對替加環素的敏感性。除了替加環素，SdeXY外排泵還介導黏質沙雷菌對四環素、環丙沙星、頭孢匹羅的耐藥性。

1.1.8 MexXY外排泵 銅綠假單胞菌對替加環素天然耐藥，其細胞膜上的主動外排系統是重要因素，其中RND家族的MexXY 外排泵在銅綠假單胞菌對替加環素產生耐藥的過程中起關鍵作用[15]。

1.2 多藥及毒性化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion, MATE）

在革蘭陽性菌中出現對替加環素耐藥的情況較少，MATE家族的mepA外排泵基因的過度表達，可能導致金黃色葡萄球菌對替加環素敏感性降低[16]。

1.3 主要易化子超家族（major facilitator super, MFS）

TetA屬于MFS超家族外排泵，ramR屬于TetR家族的轉化調節因子，ramR編碼蛋白可結合啟動子區域形成二聚體結構而抑制ramA基因的活性。Hentschke等[17]研究表明，與轉座子Tn1721有關的tetA基因以及ramR缺失或突變均可導致對替加環素耐藥。轉座子Tn1721與具有接合性、傳染性的質粒有關聯，使tetA基因得以擴散從而導致替加環素耐藥。

1.4 ATP結合盒超家族（ATP binding cassette, ABC）

MacAB-TolC外排泵屬于ABC家族，MacAB是內膜蛋白，TolC是外膜蛋白。對于革蘭陰性菌來說，TolC及其家族同源蛋白是將小分子和毒素運出外膜過程中必不可少的。野生型和臨床型替加環素耐藥的鮑曼不動桿菌菌株，替加環素誘導后，AdeIJK和MacAB-TolC的表達增強，提示其對替加環素耐藥有重要意義[18]。

2 雙組分系統

雙組分系統由組氨酸激酶（ histidine kinase ，HK）和反應調節器（response regulator ，RR）兩個基本組分構成。HK是一種跨膜蛋白，能發生自身磷酸化。RR是胞質蛋白，能轉移磷酸基團并調控DNA的轉錄。雙組分系統調節各種重要的細菌生理和代謝過程，如應激反應、營養利用、信號傳導和細胞分裂。

2.1 AdeRS雙組分系統

AdeABC外排系統受AdeRS雙組分系統調節[19]，其中AdeS是傳感器激酶，AdeR是反應調節器，adeRS 操縱子位于 adeABC操縱子的上游，與adeABC基因呈反向表達。adeS和adeR基因的點突變或者在adeS基因前插入序列ISAba1，均可使得AdeABC外排泵過度表達，導致鮑曼不動桿菌對替加環素敏感性下降[20]。Hornsey等[21]和Coyne等[22]研究發現AdeABC外排泵系統中adeS突變點（Ala-94→Val或Gly-30→ Asp或 Gly-103→ Asp） 和 adeR突變 點（Asp-20→Asn或Ala-91→ Val或Pro-116→Leu）引起外排泵過度表達，導致鮑曼不動桿菌對替加環素耐藥。

2.2 BaeSR雙組分系統

BaeSR雙組分系統首次在大腸埃希菌中發現，在ATP存在下，BaeR和BaeS可發生磷酸轉移反應，BaeS是傳感器激酶，BaeR是反應調節器，BaeSR可接收環境信號而發生細菌包膜改變反應，主要是上調外排泵的表達以應對包膜損害原的刺激。隨后發現BaeSR雙組分系統可調控AdeIJK和MacAB-TolC外排泵而導致對替加環素耐藥[18]。鮑曼不動桿菌中，RND型外排泵基因adeAB也受到BaeSR積極調控[23]。

3 核糖體蛋白

S10蛋白是核糖體30S亞基的一個組成部分，是由rpsJ基因編碼的53～60個氨基酸殘基組成，參與維持替加環素結合位點結構的正常。在大腸埃希菌中，核糖體蛋白S10通過參與rRNA操縱子的轉錄抗終止的進程而影響核糖體的生物合成，S10也是參與轉錄和翻譯少數蛋白之一[24]。核糖體蛋白S10的保守環位于30s核糖體亞基與替加環素或四環素的主要結合位點附近，該位點附近突變產生的輕微結構改變可導致抗生素與核糖體之間的親和力下降[25]。

研究表明，在革蘭陰性和陽性菌rpsJ基因57位置的突變[26]，以及57～60位置的氨基酸替換是替加環素敏感性降低的重要機制[27]。發生rpsJ基因突變的革蘭陰性菌株（大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌和鏈球菌）和革蘭陽性菌株（金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌）進行替加環素適應性試驗[26，28]，發現多種細菌通過核糖體蛋白S10來降低替加環素敏感性。核糖體蛋白S3、S10和S13相互之間非常接近四環素與核糖體亞基的結合域，核糖體蛋白S3已被證明對四環素結合域的完整性是非常重要的，因此S3蛋白的結構修飾可能會引起替加環素耐藥[29]。

4 滅活酶

一種新的替加環素耐藥機制與依賴黃素的單加氧酶TetX有關，TetX可羥化替加環素，降低其活性。替加環素是TetX的底物，TetX蛋白可修飾第一代及第二代四環素，它需要NADPH、Mg2+以及O2保持活性。在鮑曼不動桿菌中亦檢出tetX1基因與tetX基因，并可導致鮑曼不動桿菌對替加環素耐藥，其中tetX1基因僅見于對替加環素不敏感的鮑曼不動桿菌，而在敏感菌中未檢出，提示tetX1 基因的存在對細菌產生替加環素耐藥性有預測價值[30]，且tetX1和tetX有66%的同源序列。

5 細菌自我保護酶

5.1 甲基轉移酶

在細菌中，甲基轉移酶可以保護宿主基因組免受外來DNA的侵襲和干擾，且在表觀遺傳學和細菌耐藥性中起著關鍵作用。trm基因編碼S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）依賴性的甲基轉移酶，Chen等[31]發現trm基因與細菌對替加環素敏感性降低有關，通過電轉化將野生型質粒pWH-trm的trm基因分別轉入鮑曼不動桿菌的trm缺陷株19606-T2和替加環素耐藥株19606-T8，缺陷株19606-T2的替加環素最低抑菌濃度降低為原來的1/8，而耐藥株19606-T8由耐藥變為敏感。

5.2 RecA蛋白酶

RecA是細菌DNA損傷后同源基因重組和重組修復過程的重要酶。在同源基因重組過程中，該蛋白覆蓋于單鏈DNA并引導其進入雙鏈DNA，隨后催化DNA鏈之間交換修復。研究人員通過構建鮑曼不動桿菌recA突變菌株，證實RecA蛋白在鮑曼不動桿菌的DNA損傷修復、抗生素耐藥、一般壓力反應和毒力中均發揮作用。劉男男[32]在應用亞抑制濃度的替加環素處理鮑曼不動桿菌后，標準株ATCC19606recA基因的表達增強，提示RecA蛋白酶介導鮑曼不動桿菌免于抗生素損傷中發揮重要作用，從而產生耐藥。

6 細菌細胞膜的改變

6.1 磷脂的改變

基因plsC編碼的磷脂轉移酶，其可催化磷脂的生物合成進而參與細胞膜的合成。Li等[33]通過流式細胞儀檢測到plsC基因突變導致了細胞膜的改變，細胞膜的滲透屏障動態平衡發生變化，影響了細胞膜對替加環素的滲透性，從而導致鮑曼不動桿菌的耐藥，同時利用了含有plsC野生型基因的回復試驗對結果進行了確認。

6.2 脂多糖的改變

脂多糖由類脂A、核心多糖、O-抗原3部分組成，而核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid，KDO）等組成，革蘭陰性細菌都有此結構。大腸埃希菌核心多糖生物合成途徑的相關基因（lpcA、 rfaE、 rfaD、 rfaC和 rfaF）的突變菌株也出現了替加環素耐藥[34]，其中lpcA、 rfaE、 rfaD參與庚糖的生物合成，rfaC和rfaF可編碼庚糖殘基的轉移蛋白。

綜上所述，細菌對替加環素的耐藥機制十分復雜，研究主要集中于主動外排機制中RND家族外排泵，不同菌株可出現同一種耐藥機制，同一菌株又可存在不同耐藥機制，有必要加強細菌及其耐藥的檢測，合理有效使用抗生素，并針對此類耐藥菌株開發新型抗菌藥物。替加環素的耐藥菌主要為革蘭陰性桿菌，耐藥機制除了與外排泵有關，其他相關研究或可進一步深入。最新研究發現多藥物耐受性在細菌病原體中的傳播主要是由于所謂的“persisters”[35-36]的存在，它們是表型變體，處于休眠狀態，因此不易受抗生素的影響，而抗生素只對積極生長的細胞有效。

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Current insight into the mechanisms of tigecycline resistance

WANG Jian, SHEN Jilu. （Department of Laboratory Medicine, the First Affliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China）

R978.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0219-05

10.16718/j.1009-7708.2017.02.021

2016-04-18

2016-06-03

國家自然科學基金項目（81171618）。

安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科，合肥 230022。

王健（1993—），男，碩士研究生，主要從事臨床微生物耐藥機制研究。

沈繼錄，E-mail：shenjilu@126.com。