兔皮膚真菌病常見檢測方法

李代軍 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

兔皮膚真菌病常見檢測方法

李代軍 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

兔皮膚真菌病是一種由病原真菌通過侵入動物表皮及毛囊引起動物皮屑增多，脫毛等相關(guān)癥狀的疾病。近年來，兔皮膚真菌病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展造成了極其嚴重的經(jīng)濟損失。在美國、意大利等國家都有兔皮膚真菌病的發(fā)生。在國內(nèi)，黑龍江、山東青島地區(qū)也有該病的發(fā)生。

目前，用于兔皮膚病原真菌的鑒定方法主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。現(xiàn)將實驗室常用的檢測方法闡述如下。

1 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法

1.1 直接鏡檢法

臨床標本的直接顯微鏡檢查是最簡單也是最有用的實驗室診斷方法。方法是將淺部感染真菌病變標本置于載玻片上，滴加10%的KOH，覆蓋玻片后用吸水紙吸去多余液體，顯微鏡下觀察可見皮屑中有菌絲、毛發(fā)內(nèi)部或外部有成串孢子，即可初步診斷為真菌感染。該方法對淺部皮膚病原真菌感染的檢測有較大幫助，其優(yōu)點在于可以在幾分鐘內(nèi)完成診斷，簡便、快速，陽性結(jié)果可以確定為真菌感染。但直接鏡檢陽性率較低，陰性結(jié)果亦不能排除診斷；缺乏種特異性，敏感性低；易與能形成假菌絲的真菌混淆。要確診應(yīng)同時采用多種方法進行綜合性診斷。

1.2 分離培養(yǎng)

通常用沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中事先加入氯霉素等抗生素，以防止細菌和其他霉菌生長。病料培養(yǎng)于25～28℃，逐日觀察，根據(jù)培養(yǎng)基上形成的真菌菌落形態(tài)并結(jié)合鏡檢進行種屬鑒定。該方法根據(jù)真菌在培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、菌落性狀、色澤、生化實驗和菌絲及孢子形態(tài)等來鑒定病原性真菌的種屬，是國內(nèi)外學(xué)者一致認同的兔皮膚真菌病確診依據(jù)，已廣泛應(yīng)用于該病病原的分離與鑒定。但是該方法消耗時間較長，一般需要1～2周；有些非典型分離病菌還需要特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗費用高，而且需要多年的實踐經(jīng)驗和技術(shù)，更重要的是皮膚真菌在培養(yǎng)過程中易受外界因素影響，如：溫度變化、化學(xué)藥物等，可引起菌種的代謝變化及表型特征的改變，干擾真菌菌種的檢測。

2 分子生物學(xué)方法

近年來，核酸分析技術(shù)也逐漸運用到真菌鑒定中，因病原體的基因型比形態(tài)特征更具特異性及精確性，不會因外界影響因素 （如溫度改變、化學(xué)藥物）影響而改變，并且敏感度高、快速、簡便。而且它不僅能檢測出活的致病菌，而且也能檢測出死亡的和難以培養(yǎng)的真菌。這些技術(shù)包括限制性酶切片斷多態(tài)性 （RFLP）、DNA序列分析、實時熒光定量PCR和隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD或AP-PCR)等，已運用到真菌的鑒別、分類學(xué)及種系發(fā)生學(xué)等研究中，其中包括對皮膚病原真菌的研究。

2.1 序列分析

DNA序列測定能夠獲得DNA分子變異最為本質(zhì)的信息，對于了解基因結(jié)構(gòu)、表達及分子進化等具有重要意義。以DNA為研究對象是建立在基因序列差異的基礎(chǔ)上，所以序列分析是分子生物學(xué)研究中最根本的方法。DNA序列分析要求DNA含量及純度均較高，儀器設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高，限制了它在醫(yī)學(xué)真菌研究中的廣泛應(yīng)用。近年來隨著經(jīng)濟發(fā)展和人員素質(zhì)的提高，測序已成為醫(yī)學(xué)真菌分類的常用手段。DNA序列分析被認為是真菌鑒定最直接、最明確的指標之一。以往由于DNA序列測定的工作量巨大和放射性危害等缺陷，獲得大量的序列資料絕非易事。

2.2 實時熒光定量PCR

RT-qPCR是通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。該技術(shù)是對常規(guī)PCR技術(shù)的革新，其定量和擴增同步進行克服了PCR的平臺效應(yīng)；除加樣開蓋外，其后完全是閉管操作，減少污染；不需PCR后處理，避免假陽性；可直接監(jiān)測擴增中熒光信號變化獲得定量結(jié)果，精確性和靈敏度高；檢測速度快，幾個反應(yīng)可同時進行，多色熒光檢測；特異性和重復(fù)性強；應(yīng)用范圍廣，但該方法對DNA質(zhì)和量的要求較高，實驗儀器、試劑價格昂貴，不適宜臨床和實驗室大量樣品的使用。

2.3 核酸雜交技術(shù)

這是一個廣義的概念。與真菌分類學(xué)有關(guān)的包括DNADNA/RNA雜交再締合分析、核酸分子探針雜交等。然而，由于真菌基因組進化方式的原因，使得不同種間DNA重新結(jié)合的程度忽高忽低，以至難以確定供試菌之間的相互關(guān)系，使得該方法在真菌系統(tǒng)分類研究中的應(yīng)用受到限制。最常見的結(jié)果就是同一真菌種內(nèi)個體間的DNA雜交百分率高達90%，而關(guān)系很密切的種間雜交百分率就極低 (小于20%)，很少有雜交百分率為中等的物種對。因此，DNADNA雜交方法被限制于研究關(guān)系很密切的種下類群問題，也常用于幫助劃定種的范圍。該方法的缺陷是結(jié)果不易分析，研究中需要兩兩比較，相關(guān)物種的不同研究結(jié)果不易比較，而且需要DNA樣品的量較大。

2.4 限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)分析

RFLP分析是將真菌基因組DNA用特定限制性內(nèi)切酶酶解后電泳分離從而獲得高度多態(tài)性的圖譜，原則上只要內(nèi)切酶選擇合適，便對所有真菌均能顯示任何分類水平上的多態(tài)性和特異性，這一方法己在多種真菌 (包括酵母菌和絲狀真菌)中得到應(yīng)用，方法簡便，影響因素少，穩(wěn)定性高。核糖體ITS區(qū)PCR-RFLP分析是區(qū)分常見皮膚癬菌有價值的方法。

2.5 隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)分析

隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）方法是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上第一次運用隨機引物擴增，尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標志。因其能迅速擴增未知靶細胞基因片段，獲得大量多態(tài)性信息，被用于生物分類鑒定和群體生物學(xué)研究。RAPD用于醫(yī)學(xué)真菌分類和鑒定能從臨床標本中一次性的鑒定到真菌種和型的水平，能清晰分析形態(tài)學(xué)與生理學(xué)相似而遺傳特征明顯不同的真菌，特別適用于不了解基因組DNA列的真菌，方法簡便迅速，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

2.6 微衛(wèi)星引物PCR

微衛(wèi)星引物PCR是以 (GACA)4等寡核苷酸重復(fù)序列為引物對真菌的全基因組進行擴增，不同的菌株有其明顯的DNA指紋，在真菌菌種鑒定和分類上具有高效、快速等特點，以上研究結(jié)果表明，該技術(shù)對于病原學(xué)診斷、判斷感染來源及了解菌種地區(qū)分布等流行病學(xué)特點具有重要價值。

由此可見，所有的方法都有其優(yōu)點，都有一定的鑒別皮膚真菌的能力，但又都有其不足。最直接最可靠的鑒別菌種的方法是對特征性擴增條帶的序列分析，但這并不適合臨床及一般實驗室的應(yīng)用。目前真菌直接鏡檢、培養(yǎng)仍是臨床上檢測真菌感染的主要方法。RAPD因其高多態(tài)性及方法簡單的優(yōu)點具有較大的發(fā)展前景，但仍存在著缺點，需完善提高。現(xiàn)在還不能利用分子性狀重建一個最為精確、最為客觀的真菌系統(tǒng)進化關(guān)系。現(xiàn)在分類多還是以形態(tài)學(xué)形狀和生理學(xué)形狀為主，以分子為輔的方法。