七厘散含藥血清對大鼠雪旺細胞增殖分化的影響

王罡 劉大凱 趙鋼 遲曉飛

現已證明周圍神經的再生能力主要歸因于雪旺細胞, 當周圍神經損傷時 , 雪旺細胞可通過分泌神經因子、產生促突起生長因子、與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接對神經再生發揮重要作用［1］。雪旺細胞的生物學特性決定了其是周圍神經再生過程中的重要種子細胞, 并正成為周圍神經損傷修復領域中的研究熱點。七厘散由血竭、紅花、乳香、沒藥、兒茶、冰片、麝香等組成, 具有活血化瘀, 消腫止痛的功效,臨床多用于創傷后神經組織出血、水腫、微循環障礙、減緩由缺血缺氧導致的細胞凋亡［2］。為了解周圍神經損傷后中藥七厘散是否可以促使雪旺細胞增殖分化, 從而促進周圍神經損傷后的修復問題, 設計了本實驗。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡SD大鼠4只, 雌雄不限, 體重(180±30)g,均由大連醫科大學SPF動物實驗中心提供。動物均為實驗用合格應用, 處理原則符合動物實驗倫理學標準。

1.2 方法

1.2.1 雪旺細胞的培養及純化 無菌條件下分離SD大鼠臂叢神經, 用0.25%的胰蛋白酶消化, 用胎牛血清中止消化,離心以后加入DMEM/F12培養液培養。3～5 d后對細胞應用免疫磁珠陽性分選方法進行純化, 培養2 d后進行傳代接種,培養過程中對提純后的大鼠臂叢神經雪旺細胞進行形態學觀察、并繪制其生長曲線, 采用細胞免疫熒光染色對細胞進行S-100免疫熒光鑒定并且計算細胞純度。

1.2.2 七厘散含藥血清的制備 七厘散灌胃液按照0.15 g/1.5 ml配置, 每天每只大鼠灌胃2次, 間隔12 h, 連續灌胃, 取血當日早晨在灌胃, 最后麻醉大鼠開腹, 取血清混合液, 離心后過濾除菌, 以存備用。

1.2.3 不同干預分組 雪旺細胞經過貼壁培養及鑒定后P3代細胞接種于器皿中, 加入七厘散進行干預, 含量5%［3］, 設為實驗組；對照組加入等量生理鹽水。采用S-100免疫熒光法鑒定雪旺細胞及純度, 流式細胞儀檢測細胞活力及增值情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 雪旺細胞的貼壁培養及鑒定 雪旺細胞經S-100免疫熒光標記染色提示陽性細胞率達90%以上, 純化后的大鼠臂叢雪旺細胞純度為(97.5±1.3)%。5%七厘散含藥血清可以促進雪旺細胞增殖。

2.2 含藥血清干預后細胞活力 細胞計數顯示, 實驗組倍增時間為6 d, 明顯優于對照組的8 d。且實驗組A490值為(0.385±0.037), 高于對照組的(0.347±0.045), 差異有統計學意義 (P＜0.05)。

3 討論

臂叢神經損傷是一種致殘性的疾病, 主要表現以肩胛帶肌為主的疼痛、無力和肌萎縮, 且預后較差。是一種很嚴重的神經性疾病, 對患者的影響也特別嚴重。因此, 對于臂叢神經損傷患者的有效治療成為了一個急需解決的問題［4］。

雪旺細胞是一種神經纖維層的外膜, 具有可以增加神經元的存活率、促進細胞軸突生長和提高神經元再生的能力,保護正常神經傳導性的作用。因此, 雪旺細胞是周圍神經再生和周圍神經組織工程研究的重要細胞, 不僅為神經修復提供支撐, 尚可誘導神經纖維生長的方向［5］。如果能夠找到一種新的藥物, 能夠提高雪旺細胞的生物學活性, 將會對周圍神經的修復與再生, 人工神經的創建, 臨床上臂叢神經損傷的治療巨大的幫助。

七厘散是《良方集腋》中的方劑, 是治療跌打損傷的名藥,臨床用于治療疾病甚多。有研究顯示, 七厘散含藥血清顯著促進外源性骨髓間充質干細胞增殖及促進骨髓間充質干細胞成骨性分化, 表現在該組的堿性磷酸酶活性、骨鈣素、I型膠原、鈣鹽沉積量和鈣化結節數高［3］。也有研究顯示超微粉碎七厘散對急性血瘀大鼠的活血化瘀作用和垂體后葉素(Pit)誘發大鼠心肌缺血損傷的保護作用增強, 可降低其給藥劑量［6］。本研究試想通過中藥七厘散對雪旺細胞增殖分化的影響, 進一步探索其治療周圍神經的損傷作用, 實驗結果表明七厘散在適當濃度范圍內可以促進雪旺細胞的增殖,從而為促進活體神經損傷的修復提供了一些研究基礎。應用中藥治療周圍神經的損傷在臨床上確有積極的療效。

［1］ 甄雪克, 梁劍峰, 楊文強, 等.丹紅注射液對雪旺細胞中BDNF表達的促進作用研究.中華神經醫學雜志, 2014,13(6):571-575.

［2］ 劉愛軍, 陳杏曄.七厘散含藥血清對乳鼠毛囊成纖維細胞增殖的影響.陜西中醫, 2014, 35(3):375-377.

［3］ 謝興文, 徐世紅, 李寧, 等.七厘散含藥血清對骨髓間充質干細胞增殖、成骨分化的影響.中國骨質疏松雜志, 2012, 18(10):895-899.

［4］ 張柱基, 龐瑞明, 潘海文, 等.七厘散穴位貼敷對髖膝關節置換術后深靜脈血栓形成的防治.陜西中醫, 2016,37(12):1605-1607.

［5］ 李曉濤, 李長德, 解云川, 等.神經干細胞與雪旺細胞共移植對大鼠臂叢神經根性撕脫傷的療效.中國老年學雜志, 2014,33(4):974-975.

［6］ 趙國巍, 梁新麗, 王春柳, 等.超微粉碎七厘散對大鼠急性血瘀血液流變學及心肌缺血損傷保護作用的影響.中華中醫藥雜志, 2015, 30(1):299-301.