系統性紅斑狼瘡相關血管內皮細胞膜抗原的鑒定及臨床初步應用研究

曾海燕 張玲 劉超

系統性紅斑狼瘡相關血管內皮細胞膜抗原的鑒定及臨床初步應用研究

曾海燕 張玲 劉超

目的在系統性紅斑狼瘡患者血管內皮細胞中篩選與疾病有關的抗體, 分離、鑒定目標膜蛋白, 分析其在系統性紅斑狼瘡患者血清中的發生率。方法26例系統性紅斑狼瘡患者作為研究組,隨機選取26例門診進行健康檢查為正常的女性作為對照組, 利用免疫共沉淀技術分離兩組血清中免疫球蛋白G(IgG)呈特異性反應的血管內皮細胞膜蛋白, 行SDS電泳分離免疫沉淀物, 以生物信息學分析獲得靶蛋白以及其結構、功能基本信息, 以重組DNA技術建立具有體外生理活性的重組蛋白, 采用Westernblo鑒定分析蛋白在血清抗體的發生率, 比較兩組蛋白檢出率。結果研究組患者蛋白檢出率為73.1%, 高于對照組的3.8%, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論通過免疫沉淀技術分離目標蛋白, 并通過質譜技術鑒定出蛋白質, 為臨床檢測、鑒定系統性紅斑狼瘡相關抗原提供了一種新的思路。

系統性紅斑狼瘡；鑒定；血管內皮細胞膜抗原

近幾年隨著臨床研究深入, 有學者發現在系統性紅斑狼瘡患者血液中存在大量抗血管內皮細胞抗體, 通過對抗體鑒定不僅利于早期疾病診斷, 同時對臨床了解疾病發病機制等有益。本次研究通過篩選與疾病有關的抗體, 分離、鑒定目標膜蛋白, 分析其在患者疾病診斷中有效性。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1一般資料 選取2010年5月～2016年6月本院門診就診的26例系統性紅斑狼瘡患者為研究組, 患者均為女性, 年齡25～58歲。在門診經血尿常規、24蛋白尿、抗核抗體(ANA)等檢查確診為系統性紅斑狼瘡, 且排除其他自身免疫疾病。同時隨機選取26例門診進行健康檢查為正常的女性為對照組, 其經血尿常規、24蛋白尿、ANA等檢查均正常。

1. 2方法 預處理Protein G以0.15 mol/L氯化鈉溶液洗滌,并進行離心去除上清, 將等體積Protein G Beads、0.15 mol/L氯化鈉溶液混合制成50%懸液, 取兩組研究對象血清等體積與懸液混合, 靜置1 h后離心去除上清。向沉淀中加入500 μl BS3溶液, 室溫靜置30 min, 最后加入20 μl終止液(1 mol/L, Tris·HCl pH=7.5), 靜置15 min后離心去上清, 洗滌后保留沉淀。

收集培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞數為 2×106,加入裂解液200 μl M-PER, 靜置5 min離心保留上清, 向上清中加入50 μl預處理Protein G Beads懸液, 在溫度4℃環境下靜置1 h, 后離心收集上清, 將前面得到的沉淀加入上清中。混合均勻后靜置1 h, 離心去除上清, 并以0.15 mol/L氯化鈉溶液洗滌沉淀, 再次離心去除上清、洗滌, 如此重復3次,將2% CHAPS、0.5% IPG 緩沖液、7 mol/L 尿素、60 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)加入沉淀中, 充分振蕩后離心并吸取上清。

取凍存雙相電泳膠條放置至室溫后, 在IPG holder 中加入前面獲得的上清, 放入膠條并以礦物油覆蓋, 后行電聚焦。當電壓時間累積達到40000 VH后, 取出膠條、室溫平衡, 將膠條置于預制12.5% SDS 凝膠上方, 加低熔點瓊脂糖封閉,在瓊脂糖凝固后再次電泳, 直到觀察到膠底部出現溴酚藍電泳時結束, 取出凝膠。染色以5%乙酸、50%甲醇配伍的固定液固定 20 min, 使用50%甲醇洗滌, 并在離子水中過夜,放入0.02%硫代硫酸鈉中致敏 1 min, 以去離子水洗滌加入0.1%硝酸銀, 使用2%碳酸鈉、0.04%甲醛進行顯色, 最后加入5%乙酸結束銀染。

將銀染后的凝膠使用凝膠掃描系統進行掃描分析, 比較兩組研究對象凝膠中蛋白點, 篩選僅在研究組患者中出現的蛋白點, 使用質譜儀進行鑒定, 本次蛋白質質譜分析、DNA測序、以重組DNA技術構建重組蛋白均由國內相關生物技術公司完成。

檢測兩組研究對象血清中抗體水平, 將具有生理活性的重組蛋白進行電泳, 結束后轉膜, 將聚偏氟乙烯膜依次浸于甲醇、純水、轉移緩沖液, 浸泡時間依次為15 s、3 min、15 min, 將凝膠浸于電泳緩沖液5 min。按濾紙-聚偏氟乙烯-凝膠-濾紙順序一起置于半干轉印儀中進行電轉, 后將聚偏氟乙烯(PVDF)膜染色, 沿泳道剪開使用5%封閉奶粉封閉過夜, 所有研究對象血清用2.5%封閉奶粉以1∶50進行稀釋。將血清、聚偏氟乙烯膜放置于室溫中1 h, 以緩沖液TBST洗滌PVDF膜, 并將其與1∶4 000 稀釋的小鼠抗人IgG二抗進行孵育30 min, 最后加入化學發光底物進行曝光檢測。

1. 3統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1目標蛋白篩選 本次試驗以免疫共沉淀技術獲取對患者血清IgG抗體有特異性的蛋白, 以電泳方式分離免疫沉淀的混合物, 在電泳分析后發現, 對照組血清經免疫沉淀、電泳分離后, 凝膠上無明顯蛋白點, 而研究組患者凝膠上有大量蛋白點, 而這些蛋白點便是目標蛋白。

2. 2質譜鑒定目標蛋白 將目標蛋白試驗質譜儀進行鑒定,發現與系統性紅斑狼瘡相關的抗原蛋白(CASK), 通過與數據庫比對發現, 此蛋白主要存在于細胞膜上, 其功能與離子通道、細胞骨架構架有關。

2. 3鑒定重組目標蛋白 采用Westernblo鑒定該蛋白的特異性, 對目標蛋白電泳后轉膜, 在兩組血清雜交中檢測蛋白抗體, 發現該蛋白與疾病患者血清反應出現條帶, 而與正常者無反應, 在本次觀察的26例研究組患者中, 經檢驗出現條帶19例, 檢出率為73.1%, 26例對照組正常者中出現條帶1例,檢出率為3.8%, 研究組患者蛋白檢出率高于對照組, 差異具有統計學意義(P＜0.05), 表明CASK蛋白能有效區分系統性紅斑狼瘡疾病患者與正常者。

3 討論

本次研究在對患者血清抗原進行篩選檢測時, 選擇使用免疫共沉淀技術, 其不同于傳統技術, 能在HUVEC 蛋白中篩選到特異性與患者有血清反應的蛋白, 而傳統技術多通過對特異性結合抗原有親和性的介質［1］。在試驗中為避免人體自身抗體會對抗原鑒定造成干擾, 建立改良免疫共沉淀技術,使用交聯劑BS3將血清IgG與Protein G Beads交聯, 確保在離心、洗滌過程中只有抗原蛋白被洗脫下來, 從而富集、純化血清中與抗體反應的相應抗原, 能減少非特性反應［2,3］。在篩選出目標蛋白后, 為了快速獲取目標蛋白質信息, 本次使用質譜技術對目標蛋白質進行鑒定, 直接獲得氨基酸肽段序列, 并與蛋白質數據庫比對, 獲得抗原蛋白信息［4］。本次研究發現CASK蛋白對系統性紅斑狼瘡有特異性, 為驗證其與疾病相關, 通過重組DNA技術構建原核表達載體, 建立昆蟲細胞表達系統, 在優化表達條件后, 在體外獲得具有生理活性的重組目標蛋白, 并以Westernblo對CASK蛋白進行鑒定, 同時為避免假陽性, 以正常血清作為對照, 比較兩組差異。本次研究中研究組患者蛋白檢出率為73.1%, 高于對照組正常者蛋白檢出率的3.8%, 差異具有統計學意義(P＜0.05),結果表明此蛋白用于系統性紅斑狼瘡疾病鑒別、診斷有一定可行性。

綜上所述, 本次通過免疫沉淀技術分離目標蛋白, 并通過質譜技術鑒定出蛋白質, 為臨床檢測、鑒定系統性紅斑狼瘡相關抗原提供了一種新的思路。

［1］ 張曉萍, 李勇.系統性紅斑狼瘡患者抗核抗體、抗ds-DNA和ENA多肽抗體的血清學檢測.中國老年學雜志, 2013, 33(15): 3766-3767.

［2］ 吳鳳霞, 武麗君, 羅雄燕, 等.血漿可溶型人類白細胞抗原-G在系統性紅斑狼瘡患者中的表達分析.中華風濕病學雜志, 2010, 14(5):323-325.

［3］ 曹毅, 吳喬, 牟芝蓉. 系統性紅斑狼瘡中內皮細胞相關自身抗原的鑒定. 免疫學雜志, 2012(10):884-887.

［4］ 胡桑. 系統性紅斑狼瘡性腎炎相關胚胎抗原的篩選及鑒定. 廣西醫科大學, 2014.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.13.024

2017-04-18］

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