一種基于賴氨酸聚酯氨新型載藥納米水凝膠接枝真絲縫合線的抗菌性能

崔海春，伍麗麗 ，吳德群, c，俞建勇

(東華大學 a. 紡織學院； b. 紡織面料技術教育部重點實驗室；c. 產業用紡織品教育部工程研究中心； d.研究院，上海 201620)

一種基于賴氨酸聚酯氨新型載藥納米水凝膠接枝真絲縫合線的抗菌性能

崔海春a, b，伍麗麗a, b，吳德群a, b, c，俞建勇d

(東華大學 a. 紡織學院； b. 紡織面料技術教育部重點實驗室；c. 產業用紡織品教育部工程研究中心； d.研究院，上海 201620)

真絲縫合線因其優良的天然物理特性而作為一種常用的外科手術縫合線，但縫合線的結構縫隙容易藏匿細菌，其蛋白質的特性易吸附細菌，導致毛細血管作用下細菌對傷口的滲透，使得手術部位感染(SSIs)的發生率居高不下. 以一種新型生物相容性好、可降解的賴氨酸聚酯氨納米水凝膠作為抗菌劑的載體，通過化學接枝的方法將載藥納米水凝膠均勻地接枝在真絲縫合線的表面，確保真絲縫合線長效緩釋藥物而具有抗菌功能.選取金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和大腸桿菌(ATCC 25922)對接枝處理的真絲縫合線進行抑菌帶寬度、抗菌持久性等抗菌性能試驗. 結果表明，接枝了載藥納米水凝膠的真絲縫合線具有優異的長效緩釋抗菌效果.

載藥納米水凝膠； 真絲縫合線； 化學接枝； 抗菌性能

近年來，具有生物可降解功能的納米聚合物作為藥物載體已經被廣泛應用于醫療領域. 由于自身的3維多孔網絡狀結構以及高含水特性，納米尺寸聚合水凝膠與一般納米聚合物相比，其在一定類型的載藥功能方面具有更加優異的特點[1].

真絲縫合線作為一種天然蛋白質材料，因其良好的力學性能在外科手術中使用廣泛[2]. 但縫合線的編織結構以及動物蛋白性質為細菌的生長提供了良好的生長環境，同時傷口組織的縫合線會產生毛細血管作用，導致細菌在縫合線表面黏附以及定植，從而形成很難治愈的生物膜[3]. 因此，制備具有良好抗菌性能的縫合線具有重要的臨床意義.

選用三氯生作為抗菌藥物以及新型賴氨酸聚酯氨納米水凝膠作為藥物載體[4]，將含有氨基自由基的納米水凝膠接枝在具有羧基的真絲縫合線的表面，從而使得傳統的真絲縫合線具有長效抗菌的功能.

圖1 賴氨酸二丁二醇酯、對硝基苯基二羧酸酯以及賴氨酸聚酯氨水凝膠的合成Fig.1 Chemical synthesis of Lys4 monomer, di-p-nitrophenyl monomer and Lys4 based macrogels

1 試驗部分

1.1 試驗原料

L-賴氨酸鹽酸鹽(Lys)；對甲苯磺酸一水合物(TosOH·H2O)購自美國 Sigma-Aldrich 公司,分析純；己二酰氯(C7H8Cl2O2)；1,4-丁二醇購自美國Acros Organics；對硝基苯酚；三乙胺(Et3N，AR)；甲苯(C7H8，AR)；乙酸乙酯(EA，AR)；丙酮(C3H6O，AR)；N,N’-二甲基乙酰胺(DMAc)；異丙醇；胰蛋白酶；1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，BR)； N-羥基丁二酰亞胺(NHS，BR)；醫用真絲縫合線3-0購自杭州愛普醫療器械有限公司.

二羧酸酯(NA)的制備

按2∶1的摩爾比準確稱取85.12 g賴氨酸與20.00 g 1,4-丁二醇，將兩者一起混合放入1 L的單層玻璃反應釜中，加入適量的對甲苯磺酸單水合物以及甲苯，在125 ℃的條件下反應24 h，待反應完全后將甲苯倒出繼續加入異丙醇500 mL在70 ℃下溶解. 等待反應產物完全溶解后將溶液在-19 ℃下低溫保存12 h，待產物完全結晶后倒出上清液，對結晶產物連續抽真空直至產物中的異丙醇被完全抽走，收集得到賴氨酸二丁二醇酯[5]. 準確稱量60.41 g己二酰氯、110.00 g對硝基苯酚、71.88 g三乙胺以及600 mL丙酮，先后將對硝基苯酚、三乙胺以及450 mL丙酮加入1 L圓底燒瓶，常溫下采用磁力攪拌器充分混合. 在-78 ℃磁力攪拌混合液的條件下，用恒壓滴液漏斗逐滴滴入溶于150 mL丙酮的乙二酰氯溶液，充分反應4～6 h. 待反應充分后將產物倒入2 L大燒杯中反復用純水抽濾清洗，待產物中的雜質完全去除時進一步對產物進行真空干燥，去除產物中含有的水分并將對硝基苯基己二酸酯單體收集儲存.

1.3 載藥賴氨酸聚酯氨水凝膠的制備

對硝基苯基己二酸酯單體和賴氨酸二丁二醇酯按1.5∶1和2∶1的摩爾比溶于DMAc中，得到混合溶液，在45～50 ℃條件下將單體溶解，然后加入溶解有抗菌劑三氯生的三乙胺溶液，在60～80 ℃條件下反應0.5～1 h，清洗產物，得到抗菌性水凝膠4-Lys-4(1.5∶1) DL和4-Lys-4(2∶1) DL[6]. 合成方程式和配方分別如圖1和表1所示.

表1 賴氨酸聚酯氨納米水凝膠的制備配方

注：DL代表載藥水凝膠.

1.4 抗菌納米水凝膠的制備

胰蛋白酶溶于磷酸鹽緩沖溶液中，得到酶濃度為0.1 mg/mL的降解液，然后在37 ℃條件下對抗菌性水凝膠水浴降解7 d.采用相對分子質量為10萬的透析袋對得到的降解液進行透析，去除抗菌納米粒子溶液中的雜質. 冷凍干燥納米粒子溶液，得到抗菌功能的納米粒子.

1.5 抗菌真絲縫合線的制備

按摩爾比為1∶1稱取EDC和NHS，配成EDC質量濃度為0.1 g/mL的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液4 mL，在0 ℃環境下，將真絲長度為4 cm縫合線浸沒在MES緩沖液中且磁力攪拌條件下表面活化6 h，緩沖液pH值=5.5[7].

稱取抗菌納米凝膠分散在去離子水中，制成2 g/L的納米粒子溶液1 mL.

接枝前使用0.45 μm的無針式過濾器過濾納米粒子溶液，然后將納米粒子溶液加入4 mL MES緩沖液中，在0 ℃條件下磁力攪拌進行化學接枝，24 h后使用去離子水洗去真絲縫合線表面未接枝上的抗菌納米粒子等雜質，常溫干燥制得具有長效緩釋抗菌性能的真絲縫合線.

1.6 抗菌性能測試

1.7 抗張強力性能測試

選用溫州大榮紡織儀器有限公司生產的YG(B)026G型醫用紡織品強力儀作為真絲縫合線的強力測試儀器. 在恒溫恒濕條件下，試樣的拉伸初始隔距為125 mm，拉伸速度為300 mm/min[9].每種試樣測試4次，取平均值.

2 結果與分析

2.1 水凝膠紅外光譜分析

采用紅外光譜分析鑒別水凝膠的特征峰[10].水

凝膠 4-Lys-4(1.5∶1) 以及4-Lys-4(2∶1) 的紅外光譜圖如圖2所示.從圖2可以看出，4-Lys-4水凝膠在1 739 cm-1(C=O對稱伸縮振動)、1 629 cm-1(酰胺鍵I彎曲振動)以及1 550 cm-1(酰胺鍵II彎曲振動)處有特征吸收峰[4]. 通過以上分析可知，確認制備了水凝膠4-Lys-4(1.5∶1) 以及4-Lys-4(2∶1).

圖2 納米水凝膠4Lys4(1.5∶1) 和 4Lys4(2∶1)的紅外光譜 Fig.2 FTIR spectra of the lysine based nanogel 4Lys4(1.5∶1) and 4Lys4(2∶1)

2.2 水凝膠表面形貌分析

4-Lys-4 (1.5∶1)和4-Lys-4 (2∶1) 干凝膠的掃描電子顯微鏡(SEM)圖如圖3所示. 從圖3可以看出，水凝膠4-Lys-4具有豐富的3D網絡狀多空結構，并且隨著NA與Lys-4摩爾比的增加，水凝膠的交聯密度增加、孔徑變小.

(a) 4Lys4(1.5∶1)

(b) 4Lys4(2∶1)

2.3 水凝膠的溶脹分析

4-Lys-4 (1.5∶1)和4-Lys-4 (2∶1)水凝膠的溶脹速率曲線[11]如圖4所示. 從圖4可以看出，隨著NA用量的增加，凝膠的溶脹速率以及平衡溶脹率均下降，符合親水性水凝膠的溶脹性狀. 由于隨著NA與Lys-4摩爾比的增大，合成的水凝膠的交聯密度增大、孔徑減小，從而使水凝膠的溶脹能力降低.

圖4 25 °C條件下賴氨酸聚酯氨納米水凝膠在去離子水中的溶脹曲線 Fig.4 Swelling kinetics of the Lys4 based nanogels in distilled water at 25 °C

2.4 載藥納米水凝膠粒徑分析

胰蛋白酶生物降解7 d后賴氨酸基4-Lys-4納米水凝膠的透射電子顯微鏡(TEM)圖如圖5所示.在相同生物降解條件下，水凝膠降解的快慢取決于酰胺鍵的交聯密度以及水凝膠的親疏水性[4].納米水凝膠4-Lys-4(2∶1)比4-Lys-4(1.5∶1)的交聯密度大、孔徑小，因而在相同降解條件下，其降解速率比4-Lys-4(1.5∶1)慢.從圖5可以得出預載藥對納米凝膠得到的粒徑以及形貌沒有明顯影響.納米水凝膠4-Lys-4(2∶1)和4-Lys-4 (1.5∶1) 的平均粒徑分別為230和190 nm.

(a) 4-Lys-4(1.5∶1) (b) 4-Lys-4(1.5∶1)DL

(c) 4-Lys-4(2∶1) (d) 4-Lys-4(2∶1)DL

2.5 抗菌縫合線結構分析

通過SEM觀察和分析未接枝處理和經化學接枝處理過的真絲縫合線的表面形態變化，結果如圖6所示. 由圖6(a)可以看出，未經接枝前縫合線的直徑約為500 μm，表面纖維光滑且纖維之間存在大量的縫隙.由圖6(b)和6(c)可以看出，兩種接枝縫合線的纖維表面和縫隙都接有抗菌納米凝膠.

2.6 抗菌性能測試

兩種新制得的抗菌真絲縫合線對金黃色葡萄球菌的抗菌性能測試結果如圖7所示.由圖7可知：兩種真絲縫合線的抗菌性持續5 d，第5 d雖無明顯抑菌帶，但縫合線下無細菌生長；同等條件下接枝縫合線 Ⅱ(接枝4-Lys-4 (2 ∶ 1) DL納米水凝膠的縫合線)的抑菌性能比縫合線 Ⅰ(接枝4-Lys-4 (1.5 ∶ 1) DL納米水凝膠的縫合線)的抑菌性能好. 抗菌真絲縫合線對大腸肝菌的抗菌性能測試結果如圖8所示. 由圖8可知，接枝縫合線 Ⅰ 和 Ⅱ 的抗菌性持續分別為5和6 d；接枝縫合線 Ⅱ 的抗菌性能較接枝縫合線 Ⅰ 好. 綜上可得，在相同條件下納米水凝膠4-Lys-4 (2 ∶ 1)的抗菌性能好于4-Lys-4 (1.5 ∶ 1).

(a) 未接枝 (b) 接枝4-Lys-4 (1.5 ∶ 1) DL (c) 接枝4-Lys-4 (2 ∶ 1) DL

(a)

(b)

(b)

圖8 兩種抗菌真絲縫合線對大腸桿菌抑菌圈寬度

Fig.8 Zone of inhibition of two antibacterial silk sutures against E.coli

2.7 抗張強力性能測試

真絲縫合線接枝前后的抗張強力測試結果如表2所示. 由表2可知，化學接枝后真絲縫合線的平均抗張強力略小于接枝前真絲縫合線，但都大于國家標準要求的最低強力9.41 N.

表2 接枝前后真絲縫合線的抗張強力平均值

Table 2 Mean tensile strength values of silk sutures before and after grafting

N

3 結 語

本文以賴氨酸鹽酸鹽、己二酰氯為原料，合成賴氨酸聚酯氨水凝膠為藥物載體，在同等條件下由不同NA與Lys-4的摩爾比制得兩種不同的抗菌納米凝膠. 利用納米凝膠表面的羧基自由基將載藥納米凝膠接枝在具有氨基的真絲縫合線表面，并對接枝后的真絲縫合線進行抗菌性能測試. 測試結果表明，接枝處理后的真絲縫合線具有優良的抗菌性能，同時基本保留了原有的物理性能. 隨著NA與Lys-4摩爾比的增加，使得合成的水凝膠交聯密度變大、載藥能力加強，接枝4-Lys-4(2 ∶ 1) DL納米水凝膠的縫合線的抑菌性能要好于接枝4-Lys-4(1.5 ∶ 1) DL納米水凝膠的縫合線.

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A Novel Lysine Based Drug Loading Nanogel Carrier Grafted Silk Sutures Against Pathogens

CUIHai-chuna,b，WULi-lia,b，WUDe-quna,b,c,YUJian-yongd

(a. College of Textiles；b. Key Laboratory of Textile Science & Technology, Ministry of Education； c. Engineering Research Center of Technical Textiles, Ministry of Education；d. Research Institute, Donghua University，Shanghai 201620，China)

Silk sutures can be commonly used in surgeries for its nature and physical properties. However, silk sutures also could cause challenging surgical site infections, due to the suture structure cracks easily hiding bacteria and the adsorption capillary effects resulting in bacteria permeating wounds. Through the methods of chemical grafting, a new type of biocompatibility, biodegradable lysine drug-loading nanogels were grafted on the surface of silk suture, to ensure that the silk suture has long-term slow-release antibacterial function. Antimicrobial tests against gram negative bacteria Escherichia coli (ATC 25922) and gram positive bacteria Staphylococcus aureus (ATC 25923) were then carried out to compare the efficacy and drug release assay. The results reveal that the grafting sutures have excellent sustained antibacterial efficacy.

drug loading nanogels; silk suture; chemical grafting; antibacterial performance

1671-0444 (2016)06

2015-09-10

中央高校基礎研究基金資助項目；浦江人才計劃資助項目(14PJ1400300)

崔海春(1989—)，男，安徽蚌埠人，碩士研究生，研究方向為新型抗菌手術縫合線. E-mail: haichuncui@163.com 吳德群(聯系人)，男，副教授，E-mail: dqwu@dhu.edu.cn

TS 141.8

A