影響中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）發揮作用的因素分析

梁俏美，馬仁舒，李春妹，沈佳程，梁妍雯，劉 偉 （河北醫科大學基礎醫學院，河北醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，河北省重大疾病的免疫機制及干預重點實驗室，河北石家莊05007）

影響中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）發揮作用的因素分析

梁俏美1，馬仁舒1，李春妹1，沈佳程1，梁妍雯1，劉 偉2（1河北醫科大學基礎醫學院，2河北醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，河北省重大疾病的免疫機制及干預重點實驗室，河北石家莊050017）

中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）是一種新型免疫防御機制，本文擬探討影響其發揮作用的因素.通過Pubmed、Embase等數據庫檢索最新文獻，對其進行閱讀篩選，收集多種關于影響NETs作用的因素，針對各種因素對NETs作用的影響進行歸納概述.結果發現，影響NETs發揮作用的因素主要體現在促進、誘導、抑制三個方面.綜上所述，許多研究表明影響NETs作用的因素與疾病有一定的聯系，對其進一步研究可以給臨床工作者提供一個NETs參與作用的相關疾病的治療方向，并為評估疾病預后提供一個診斷工具.

中性粒細胞胞外誘捕網；非特異性免疫；影響因素

0 引言

傳統上，中性粒細胞（poly morphonuclear neutro?phil，PMN）主要被認為是發生急性炎癥時第一個被招募到炎癥組織的免疫細胞，亦是由巨噬細胞分泌的趨化因子吸引聚集至局部細胞接觸微生物病原體的感染部位.相比之下，它們在慢性炎癥中的重要性仍缺少深入研究，因此吸引了Soehnlein等［1］的研究.現今，一種新型防御機制——中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellar traps，NETs），為宿主細胞捕獲和殺滅胞外微生物提供了一種新的途徑，在先天性免疫系統中起著重要的作用，并且在血液循環中的嗜中性粒細胞形成不穩定的聚集體能引發對炎癥介質的強烈反應［2］，這能促進各種炎癥和自身免疫疾病發病.PMN能釋放NETs并死于NETosis.NETosis是一種細胞凋亡途徑，它能釋放由染色質，組蛋白和顆粒蛋白組成的網狀細胞結構，延緩小鼠和人類的糖尿病性傷口愈合［3］.近年來Jorgensen等［4］研究發現，細胞間存在清除已捕獲細菌的細胞的特異性免疫功能，并具有通過促進淋巴細胞增多來清除嗜中性粒細胞的焦磷酸細胞碎片機制.因此，NETs參與著各種相關疾病的發生發展過程，尋找可靠的影響NETs形成的因素對提高相關疾病的治療有很大幫助.

1 促進或誘導NETs形成的因素

1.1 蛋白質

1.1.1 氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lip?oprotein，oxLDL） Awasthi等［5］研究發現PKC和IRAK為MAPK途徑的上游能阻斷Toll樣受體2和6，使oxLDL誘導形成的NETs顯著減少.同時發現oxLDL以濃度和時間依賴性方式誘導NETs釋放，其中大多組分有誘導NETs釋放的潛力，如氧化磷脂是最有效的NETs誘導劑，并且可能對oxLDL介導NETs釋放非常關鍵.然而，另外組分如氧固醇，丙二醛和4?羥基壬烯醛與氧化磷脂相比效力較低.這些也預示著oxLDL在不存在微生物刺激的情況下可作為NETs的潛在誘導劑，從而加重相關疾病的病理生理狀況.

1.1.2 P?選擇素 已有研究表明，P?選擇素是介導血小板與中性粒細胞相互作用的最重要的分子，它主要通過P?選擇素糖蛋白配體1（P?selectin glycoprotein ligand?1，PSGL?1）觸發PMN的活化信號，從而誘導PMN活化和NETs釋放.P?選擇素能促進嗜PMN中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，這一過程對該選擇素誘導NETs形成有著十分關鍵的作用［6］，該發現進一步支持了P?選擇素/PSGL?1抑制劑治療劑的臨床發展，可有效地減少病理性血栓形成和炎癥發生.最近，Panicker等［7］實驗發現，升高的血漿sP?選擇蛋白僅是一個后果，而不是心血管疾病發生的原因.這從側面可以看出P?選擇素及其相關分子在導致血栓形成的過程中，有著加速疾病發生發展的作用.

1.1.3 CD11b/CD18配體 PMN是哺乳動物機體內重要的天然免疫細胞，作為宿主防御的第一道防線，PMN通過模式識別受體（pattern recognition recep?tors，PRRS）感知病原，識別病原相關分子模式（pathogen?associated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（damage?associated molecular pat?terns，DAMPs），啟動機體先天免疫反應如NETs機制［8］.CD11b/CD18介導的細胞吸附是細胞發揮免疫功能所必需的.正常情況下，CD11b/CD18沒有吸附性，其以一種未活化、低親和力狀態存在，通過構象彎曲，配體結合位點不能獲得潛在的配體，當細胞被LPS、IL?8等因子激活以后觸發細胞內信號級聯反應，通過構象改變引起胞質尾部的分離，致使整合素打開，暴露配體結合位點，使高親和性CD11b/CD18能夠與配體結合介導PMN吸附、滲出［9］，從而有利于阻止病原微生物的入侵，發揮著機體感染與抗感染的重要作用.

1.2 病原體

1.2.1 阿米巴 2016年6月Ventura?Juarez等［10］首次證實溶組織阿米巴營養體能直接體外接觸并激活人PMN釋放NETs.溶組織阿米巴營養體膜上的脂肽磷酸聚糖可被PMN膜受體TLR2和TLR4識別，從而誘導活性氧和氮物質的產生.研究發現，用TNF?α和IFNc處理人PMN后會發生以上反應.另外，充分活化的PMN能在抵抗溶組織阿米巴滋養體侵襲的過程中誘導NETs形成和釋放發揮作用，而未充分活化的中性粒細胞可能會抑制NETs形成，這樣使得易感個體和物種的組織損傷加重.

1.3 血液組分

1.3.1 血小板 Thalin等［11］研究發現，在癌癥相關腦梗死的患者中，患者的NETs明顯升高，并且PMN前體、G?CSF、NETs的特異性標志物H3Cit在癌癥患者中也有所升高，由此推測NETs可通過活化血小板及凝血因子發生促凝作用，從而促進動脈微小栓子的形成，導致癌癥相關腦梗死的發生.Abdol等［12］研究顯示，胰腺癌（PaCa）細胞可以刺激NETs快速釋放，并且不需要依賴于ROS.他們還進一步評估了血小板在PaCa中誘導NETs的作用，并觀察到PaCa激發的血小板能夠使NETs釋放增多.此外，NETs在靜脈切斷應激下促進血栓形成，即PaCa誘導的NETs很大可能使PaCa患者并發靜脈血栓栓塞，并可將NETs視為潛在的治療靶點.綜上所述，血小板與NETs兩者相互影響，共同在癌癥的發生發展過程中起著一定的作用.

1.4 其他近幾年醫學界發現的其他一些蛋白質類和其他類物質及它們的促進或誘導機制如下：AgNPs（silver nanoparticles），一種新介質，可誘導被粘附的PMN釋放NET［13］；肝氧蛋白A3直接誘導人類嗜中性粒細胞NET形成［14］；Cacciotto等［15］實驗表明，獨立的二棕櫚酰基?S?甘油基?半胱氨酸脂肽序列能有效刺激NETs釋放，表明對于由支原體脂蛋白介導的NET釋放，重要的是脂質組分而不是蛋白質組分.另外還有侵襲素，b1整合素等許多物質誘導或促進著NETs形成，對疾病的發生發展有著潛在的影響.

2 抑制NETs形成的因素

2.1 蛋白質

2.1.1 新生兒NET抑制因子 存在于臍帶血中的新生兒NET抑制因子（neonatal NET inhibitory factor，nNIF）是抑制NETs形成的關鍵終末事件.Yost等［16］研究表明nNIF可能是胎兒和新生兒炎癥中NETs形成的重要調節劑.人類新生兒具有復雜而獨特的易感性感染和炎性病理的免疫調節系統.研究發現從早產和妊娠期臍帶血中分離出的PMN在被刺激時不會形成NETs，并且在NET介導的細菌殺傷中存在缺陷.現有研究應用活細胞成像進行定性評估NET形成與SYTO綠和SYTOX橙色DNA染色和通過上清液定量NET測量相關組蛋白H3，這些結果表明nNIF及相關分子是早產兒和新生兒期臍帶血中NET形成的抑制劑［11］.還有實驗共同證明了nNIF和CRISPP抑制NET形成并為它們在全身性無菌炎癥感染的模型中具有有益效果提供了初步證據［17－19］.

2.1.2 中間普雷沃氏菌的核酸酶 已有研究表明，許多細菌病原體產生細胞外核酸酶來降解由PMN產生的NET支架DNA，使細菌逃避宿主的抗菌機制而導致其致病性增加.近年來，有報道證實許多牙周病致病菌能產生細胞外DNA核酸酶，能協助致病菌逃脫NET殺傷，從而增加毒力.但是，這些核酸酶的遺傳多樣性和功能作用在很大程度上是未知的［20－21］.Doke等［22］研究發現口腔周期致病性細菌產生兩種核酸酶NucA和NucD，能使周期致病性細菌通過其核酸酶活性的機制逃避NETs先天防御，因此核酸酶活性可能是牙周細菌躲避抗菌機制并在牙齦上增生繁殖的過程中必不可少的.

2.1.3 磷脂酶D2 敗血癥是一種由入侵的感染微生物引起的全身性炎癥反應綜合征，目前并沒有有效的療法來改善患者的生存.敗血癥誘發的死亡率上升與宿主的吞噬和破壞入侵病原體的先天免疫缺失密切相關.磷脂酶D2（phospholipases D2，PLD2）是關鍵的細胞信號轉導酶，能夠水解磷脂酰膽堿生成磷脂酸和膽堿，還可以結合并激活許多不同的激酶、磷酸酶.核苷酸結合蛋白質和磷脂酶可以控制細胞遷移、增殖和活化.Lee等［23］使用PLD2/R/小鼠和PLD2特異性抑制劑的敗血癥小鼠模型確定PLD2在宿主防御中有高度致死功能.PLD2缺乏不僅可以提高生存率，而且能夠減少實驗性膿毒癥期間的生命器官損傷.研究還表明PLD2在嗜中性粒細胞中是實驗膿毒癥發病機制和靶向PLD2藥物的必要條件，這可證明其對膿毒癥患者有益.

2.2 藥物

2.2.1 南蛇藤醇 南蛇藤醇是中國草藥學雷公藤F（TWHF）兩種主要活性成分之一.實驗證明南蛇藤醇能夠下調促炎性細胞因子的表達，并調節許多炎癥相關分子如JAK2，轉錄因子NF?κB，NADPH氧化酶，MHCⅡ等活性.不僅如此，它還可以抑制NET形成并下調SYK?MEK?ERK?NFκB信號串聯，導致瓜氨酸化的組蛋白水平下調［24］.研究發現，南蛇藤醇能夠抑制各種刺激誘導的SYK磷酸化，從而降低SYK活性，具有減弱后續通路的作用，使NETs形成減少［24］.由于SYK是作用在Raf?MEK?ERK上游的激酶，因此SYK（脾酪氨酸激酶）能作為南蛇藤醇作用新的分子靶位，使得南蛇藤醇有望成為治療某些炎癥疾病的有效藥物.同時Yu等［24］也研究發現進行南蛇藤醇治療時，其濃度超過10μM能增加細胞的死亡.對此，發展低毒性和高溶解度的南蛇藤醇派生物是解決這一臨床使用障礙的方法.

2.2.2 Cl脒 Cl脒（Amidine）能通過阻止H3瓜氨酸化來抑制NET形成［25］.最近研究［26－27］表明，PAD4通過介導提高靶組蛋白H3，H4及H2A瓜氨酸化的核染色質解聚，在NET形成中起調節作用.PADs包括PAD4的抑制藥物Cl脒通過共價修飾半胱氨酸活性位點不可逆地抑制PADs活性，進而抑制H3瓜氨酸化以減少NETs的形成.Knight等［28］也研究發現，使用PAD抑制劑治療狼瘡型小鼠，可以調節自身免疫反應并有效防止NET介導的血管損傷.

2.3 其他此外，還有許多物質有著抑制NETs形成的作用，如蛋白質類：前列腺素E2［29］，分泌性白細胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）［30］，肽基精氨酸脫亞氨酶（peptidyl arginine de?iminase，PAD）［31］，真菌多糖半乳糖胺基半乳糖［32］，M1T1組鏈球菌膠原樣蛋白1，蛋白酶體等，這些物質都有著各自影響NETs形成的機制，對疾病的發生發展有著重要的臨床研究意義.

3 結語

眾多研究已證實NETs具有強效的抗菌作用，并且參與多種疾病的發生發展過程，同時也對自身細胞和組織造成一定的損害.因此，探討影響NETs形成的因素是極其重要的，對其進行合理的歸類分析，能夠更加清晰地了解各種因素與NETs之間錯綜復雜的聯系，亦能為科研人員和臨床工作者提供一些藥物研究和疾病治療的方向，從而有效地幫助各類疾病患者擺脫疾病困擾.

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Analysis on factors affecting the role of neutrophil extracellular traps（NETs）

LIANG Qiao-Mei1，MA Ren-Shu1，LI Chun-Mei1，SHEN Jia-Cheng1，LIANG Yan-Wen1，LIU Wei21Basic Medical College，Hebei Medical University，2Department of Immunology，Basic Medical College of Hebei Medical Universi?ty，Key Laboratory of Immune Mechanism and Intervention on Se?rious Disease，Shijiazhuang 050017，China

Neutrophil extracellular trapps（NETs）is a new type of immune defense mechanism，this paper intends to investigate the role of its influencing factors.Through Pubmed，Embase and other databases，we retrieved the latest literature，read the screenings，collected a variety of factors affecting the role of NETs，and summarized the factors affecting NETs.As a result，the factors affecting the role of NETs mainly include promotion，induction and suppression three aspects.In summary，many stud?ies have shown that the factors influencing the role of NETs are associated with the disease，and further studies can provide clini?cians with a treatment of the relevant diseases of NETs and a diag?nostic tool for assessing the prognosis of the disease.

neutrophil extracellular traps（NETs）；non?specific immunity；influencing factors

R392.1

A

2017－09－09；接受日期：2017－09－25

河北省科技計劃項目（152777201）；河北省博士后科研項目擇優資助項目（B2015003029）；河北省高等教育學會項目（GJXH2013－135）

梁俏美.本科.研究方向：腫瘤免疫.E?mail：597367486＠qq.com

劉 偉.博士.研究方向：腫瘤免疫.E?mail：liuweihebmu＠hebmu.edu.cn

2095?6894（2017）10?77?04