一種防治小菜蛾的菌劑制備方法和藥效評(píng)價(jià)

劉春光　楊峰山

小菜蛾，鱗翅目菜蛾科，別名：小青蟲、兩頭尖，是田間常見的害蟲之一，是世界性遷飛害蟲。主要為害甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、蘿卜等十字花科植物。蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑自1938年在法國問世以來，已取得了長足的發(fā)展，開發(fā)的劑型也已經(jīng)有很多種，近一百年的研究開發(fā)，使得以蘇云金芽孢桿菌微生物源的微生物殺蟲劑逐漸成熟完善，田問防治效果達(dá)到80%以上的在我國就有二十多種，但在應(yīng)用過程中還存在主要起效成分不穩(wěn)定。致使活性成分的保質(zhì)期和持效期差等眾多問題。蘇云金粉劑所含伴孢晶體和芽孢以干粉狀態(tài)存在，具有耐貯藏、運(yùn)輸方便、使用性強(qiáng)、效價(jià)高等特點(diǎn)。但由于粉劑不易被水濕潤，也不易分散和懸浮在水中，稀釋噴霧較困難。

普魯蘭多糖具為白色非吸濕性的粉狀物，無毒、無致畸性、無味，易溶于冷水，具有水溶性、成纖維性、吸水性等獨(dú)特的性質(zhì)，由于普魯蘭多糖良好的成膜特性，更有助于保持蘇云金芽孢桿菌的活性，因此利用普魯蘭多糖作為藥物釋放系統(tǒng)載體材料的研究越來越受到人們的重視。本研究以東北地區(qū)田問非正常死亡的小菜蛾幼蟲作為實(shí)驗(yàn)材料，從其體內(nèi)成功分離出對(duì)東北地區(qū)小菜蛾具有高毒性的蘇云金芽孢桿菌，開發(fā)了一種防治小菜蛾的含有普魯蘭多糖的蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法，并進(jìn)行了藥效評(píng)價(jià)。

1菌劑的制備方法

1.1配制LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，固體培養(yǎng)基再加入瓊脂粉15g/L；取保藏的蘇云金芽孢桿菌接種于LB固體斜面培養(yǎng)基上，在30℃條件下培養(yǎng)24h，然后再在LB固體斜面培養(yǎng)基上用接種環(huán)挑取菌苔轉(zhuǎn)接于5mL LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速搖菌12h，作為蘇云金芽孢桿菌種子菌液；

1.2配制發(fā)酵培養(yǎng)基：將葡萄糖、黃豆餅粉、酵母粉、魚粉、蛋白胨、磷酸氫二鉀和氯化鈣溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中葡萄糖20g/L，黃豆餅粉20g/L，酵母粉16g/L，魚粉20g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氫二鉀20g/L，氯化鈣230g/L，調(diào)pH值至6.8-7.0，裝入250mL三角瓶中。在0.14Mpa壓力下滅菌30min；然后將種子菌液按體積分?jǐn)?shù)為2%接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃條件下。以200r/min的轉(zhuǎn)速搖菌40-50h，直至芽孢脫落量為45%-55%。得到蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液；

1.3用1mol/L醋酸溶液將發(fā)酵液調(diào)至pH值4.5，然后分裝到2個(gè)離心管中，以5000-8000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，然后回收沉淀，得到芽孢和伴孢晶體混合物，芽孢和伴孢晶體的數(shù)量比為0.8-1.2：1；

1.4按重量百分比加入50%-70%芽孢和伴孢晶體混合物、0.5%-5%的載體和1%-5%的氯化鈉，攪拌均勻；

1.5混勻后按重量百分比加入5%-20%的潤濕劑和5%-20%的分散劑。攪拌均勻。在50-70℃條件下烘干至含水質(zhì)量百分?jǐn)?shù)3%-4%時(shí)取出，然后研磨，再經(jīng)過200目篩子，得到一種蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑。

2菌劑載體、潤濕劑和分散劑的選擇

制備方法中步驟四中的載體為人造沸石、高嶺土或硅藻土；步驟五中的潤濕劑為十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉，分散劑為普魯蘭多糖或羥甲基纖維素鈉。按照上述方法制備后，統(tǒng)計(jì)活芽孢含量，測(cè)定后得出載體對(duì)蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑中的芽孢具有保護(hù)作用，且不同載體對(duì)蘇云金芽孢桿菌的保護(hù)作用有差異，如高嶺土和硅藻土在重量百分比1.0%-3.0%濃度時(shí)對(duì)蘇云金芽孢桿菌的保護(hù)作用達(dá)到最高值。而人造沸石則在重量百分比5.0%的濃度下才能達(dá)到較高的保護(hù)作用；而且加了潤濕劑的樣品潤濕時(shí)間明顯少于不加潤濕劑的對(duì)照，其中潤濕劑十二烷基苯磺酸鈉的效果較好。

3菌劑對(duì)小菜蛾的藥效試驗(yàn)

將含普魯蘭多糖蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑和含羥甲基纖維素鈉蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑分別保存1天、3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，利用小菜蛾2齡幼蟲進(jìn)行生物活性測(cè)定。

具體測(cè)定方法為：用浸葉法將制備好的含不同分散劑的蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑分別稀釋至10-3，均勻涂抹在新鮮的甘藍(lán)菜葉上，自然晾干后放人9cm平皿內(nèi)，底部放濕濾紙，每皿接人幼蟲20頭。每個(gè)處理重復(fù)3次，同時(shí)用無菌水涂抹在新鮮的甘藍(lán)菜葉上做空白對(duì)照，處理后置于溫度為26±1℃，光照時(shí)間達(dá)14h的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后觀察小菜蛾幼蟲的生長狀況，記錄活蟲數(shù)。計(jì)算校正死亡率。

4菌劑的藥效評(píng)價(jià)

本研究制備的含有普魯蘭多糖的蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑中蘇云金芽孢桿菌活芽孢含量8±0-9±2×109個(gè)/g，pH7.2；通過200目篩后細(xì)度為99.9%，而目前國家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)度為98%；懸浮率（即有效含量）72%，高于目前國家標(biāo)準(zhǔn)的懸浮率70%；潤濕時(shí)間為123s。明顯縮短于國家標(biāo)準(zhǔn)潤濕時(shí)間180s；水分重量百分?jǐn)?shù)3.8%。國家標(biāo)準(zhǔn)為4%；保存期6個(gè)月時(shí)用本研究得到的普魯蘭多糖的蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑處理，校正死亡率為96%，蘇云金芽孢桿菌的活性高。而使用羥甲基纖維素鈉制備的蘇云金芽孢桿菌粉劑校正死亡率僅為90%。

綜上所述，本研究得到的粉劑中蘇云金芽孢桿菌的活性高，保質(zhì)期和持效期長，能夠廣泛應(yīng)用于田間防治農(nóng)業(yè)害蟲領(lǐng)域。