水蓼化學(xué)成分抑菌和抗氧化活性研究

馬養(yǎng)民， 李夢(mèng)云， 郭林新， 喬 珂， 范 超

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021)

水蓼化學(xué)成分抑菌和抗氧化活性研究

馬養(yǎng)民， 李夢(mèng)云， 郭林新， 喬 珂， 范 超

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021)

為了研究從水蓼中分離得到的11個(gè)化合物的抑菌活性及其中部分化合物的抗氧化活性，采用96孔板二倍稀釋法進(jìn)行抑菌活性測(cè)試，以最小抑菌濃度(MIC)考察各化合物的抑菌能力強(qiáng)弱；通過(guò)DPPH法測(cè)定自由基清除率，利用origin 70擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各化合物的IC50，以此反映其抗氧化能力大小.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從水蓼中分離出的11個(gè)化合物對(duì)各細(xì)菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中黃酮類(lèi)化合物的抑菌效果較好，槲皮素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最好，最小抑菌濃度為31.3μg·mL-1；所檢測(cè)的化合物均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，其中槲皮素、沒(méi)食子酸和鞣花酸的抗氧化能力強(qiáng)于Vc.結(jié)果表明從水蓼中分離得到化合物有良好的抑菌和抗氧化活性，其中黃酮類(lèi)化合物的活性強(qiáng)弱因其結(jié)構(gòu)的不同而表現(xiàn)出明顯的差異，烯醇式結(jié)構(gòu)較多的化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力.

水蓼； 化學(xué)成分； 抑菌活性； 抗氧化活性； 構(gòu)效關(guān)系

0 引言

蓼屬(Polygonum)是蓼科(Polygonacea)中的藥用大屬[1].全世界約300余種，我國(guó)有120多種，秦嶺產(chǎn)8屬，52種，6變種.在我國(guó)，約有81種蓼屬植物供藥用，且廣布于全國(guó)各地.其大多具有活血止痛、清熱解毒、散結(jié)消腫、收斂止瀉、順氣解痙、通經(jīng)利尿等功效[2].諸多常用的著名中草藥如何首烏(P.multiforumThunb.)、虎杖(P.cuspidatumSieb. Et Zucc.)、紅蓼(又名葒草，P.orientaleL .)、拳參(P.bistortaL .)皆出于蓼屬[3].另有一部分為民間習(xí)用藥材.

水蓼(PolygonumhydropiperL.)是蓼屬一年生草本植物，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，來(lái)源相當(dāng)廣泛[4].其味辛，冷，無(wú)毒，內(nèi)用可治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、疥癬、痢疾、腹瀉、腳氣、腸胃炎、功能性子宮出血、跌打腫痛，外用可治皮膚濕疹、毒蛇咬傷等[5].水蓼具有抗微生物、殺蟲(chóng)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[6]，在植物源農(nóng)藥[7]，獸藥，醫(yī)藥及食品添加劑等方面均有應(yīng)用.但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)水蓼的研究多集中在該植物主要化學(xué)成分的基礎(chǔ)研究，對(duì)其所含化學(xué)成分活性的研究較少.因此本文通過(guò)對(duì)從水蓼中分離得到的11種化合物進(jìn)行體外生物活性檢測(cè)，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用水蓼的藥用植物資源奠定一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

(1)儀器及試劑：超凈工作臺(tái)(ZHJH-C11098)，上海智城分析儀器制造有限公司；手提式蒸汽壓力滅菌鍋(YX-2803)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DH5000B)，天津泰斯特儀器有限公司；酶標(biāo)分析儀(DNM-9602A)，北京普朗新技術(shù)有限公司；costar 96孔酶標(biāo)板(3590)，美國(guó)Corning Costar公司；baygene 移液槍(S200)，北京百晶生物技術(shù)有限公司；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

(2)測(cè)試菌：革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和乳鏈球菌(Streptococcuslactis)以及革蘭氏陰性菌：綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和大腸桿菌(Esherichiacoli).

(3)肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏12.0 g，瓊脂8.0 g，蛋白胨24.0 g，氯化鈉12.0 g，水1 200 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.2 方法

1.2.1 提取與分離鑒定

干燥水蓼全草13.1 Kg粉碎后用95%酒精浸泡，回流提取4次，合并提取液，減壓蒸餾濃縮后得浸膏1.0 Kg.加水使其懸浮，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收萃取溶劑后得到四個(gè)部分：石油醚萃取物92.0 g，乙酸乙酯萃取物81.8 g，正丁醇萃取物59.9 g，萃取后水溶性部分284.0 g.石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取物通過(guò)硅膠柱色譜洗脫后，石油醚相得到6個(gè)組分(Fr.A1～A6)，乙酸乙酯相得到8個(gè)組分(Fr.B1～B8)，正丁醇相得到7個(gè)組分(Fr.C1～C7).再經(jīng)多次硅膠柱層析、凝膠柱層析、重結(jié)晶等手段從Fr.A4和Fr.A5中分別分離純化得到化合物1和化合物2；Fr.B1～B5中分離純化得化合物3～9；Fr.C3和Fr.C4中分別分離得到化合物10和化合物11.通過(guò)NMR、MS等波譜手段對(duì)以上化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定后，依次確定為β-谷甾醇(1)、aniba dimer A(2)、琥珀酸(3)、槲皮素(4)、沒(méi)食子酸(5)、胡蘿卜苷(6)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(7)、槲皮素-3-O-β-半乳糖苷(8)、山柰酚-3-O-β-半乳糖苷(9)、富馬酸(10)、鞣花酸(11)，其中化合物2、9、10和11為首次從水蓼中分離得到.

1.2.2 抑菌活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)[8]，用DMSO分別溶解待測(cè)化合物，依次配成質(zhì)量濃度為1 000μg·mL-1的溶液.將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基加入到96孔板每行的第1至11孔中，每孔100μL.向第1孔中加入100μL待測(cè)樣品溶液，混合均勻后吸取100μL加入到第2孔中，再?gòu)牡诙孜?00μL加入到第3孔中混合均勻.如此連續(xù)稀釋至第10孔，從第10孔中吸取100μL棄去.第11孔和第12孔分別作為培養(yǎng)基和DMSO溶劑陰性對(duì)照.第1～10孔中化合物的質(zhì)量濃度依次為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.98μg·mL-1.用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配制濃度為106CFU·mL-1活性測(cè)試菌菌懸液，向96孔板每孔中加入100μL菌懸液.青霉素鈉作為革蘭氏陽(yáng)性菌的陽(yáng)性對(duì)照，硫酸鏈霉素作為革蘭氏陰性菌的陽(yáng)性對(duì)照，每組樣品設(shè)置3個(gè)平行組.將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.2.3 抗氧化活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)[9-11] ，用甲醇將待測(cè)化合物依次配成質(zhì)量濃度為2 000μg·mL-1的溶液，同時(shí)配制200μg·m-1的DPPH甲醇溶液.首先向96孔酶標(biāo)板的第一排和第二排每孔中依次加入100μL甲醇，其次，在兩排的第一孔中各加入100μL待測(cè)樣品，每排第1孔混合均勻后吸取100μL加入到第2孔中，再?gòu)牡?孔吸取100μL加入到第3孔混合均勻，按此法操作至第11個(gè)孔，吸取100μL溶液棄去，最后一孔不加樣品作為空白對(duì)照.最后，向第一排每孔中加入100μL配制好的DPPH溶液，第二排每孔中加入100μL甲醇.將上述96孔酶標(biāo)板放置在室溫、避光條件下反應(yīng)30 min后將酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置成517 nm測(cè)定其吸光度.以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照.

計(jì)算自由基清除率：自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，其中Ai為DPPH溶液加待測(cè)樣品溶液的吸光度；Aj為甲醇溶液加待測(cè)樣品溶液的吸光度；A0為甲醇溶液加DPPH溶液的吸光度.因所測(cè)定化合物的濃度和其對(duì)DPPH自由基的清除率呈線性關(guān)系，故以自由基清除率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)可建立量效關(guān)系曲線，通過(guò)量效關(guān)系曲線可求出自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50).

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌活性測(cè)試結(jié)果

抑菌活性大小由最小抑菌濃度(MIC)來(lái)判斷，最小抑菌濃度越小表示其抑菌活性越好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示.

表1 單體化合物抑菌活性測(cè)試結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所測(cè)定的化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、乳鏈球菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌均有一定的抑制作用.首次分離得到的化合物2、9、10和11對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用因其結(jié)構(gòu)不同而表現(xiàn)出一定的差異.不同黃酮類(lèi)化合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌.槲皮素對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度最小，為31.2 μg·m-1，表明其抑菌效果最好.當(dāng)槲皮素上3-OH基團(tuán)被糖苷取代后抑菌活性有所下降且對(duì)不同的細(xì)菌影響效果不同.相關(guān)研究[12,13]表明黃酮類(lèi)化合物3-OH基團(tuán)對(duì)該化合物的抑菌活性有一定的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此結(jié)論相符.

2.2 抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

以IC50值來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力，IC50值越小表示其抗氧化能力越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

表2 單體化合物抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所測(cè)定的化合物均有良好的抗氧化活性，首次從水蓼中分離得到的鞣花酸的抗氧化能力強(qiáng)于維生素C，山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷的抗氧化能力也相對(duì)較好.此外，槲皮素和沒(méi)食子酸的抗氧化活性顯著，當(dāng)槲皮素上3-OH被糖苷取代后抗氧化能力有所降低, 槲皮素苷類(lèi)化合物失去3′-OH時(shí)，抗氧化能力也有所下降.從化合物結(jié)構(gòu)上出發(fā)(化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示)，分析化合物抗氧化構(gòu)效關(guān)系如下文所述.

(a)槲皮素 (b)沒(méi)食子酸

(c) 槲皮素-3-O-β- (d) 槲皮素-3-O-β- D-葡萄糖苷 半乳糖苷

(e) 山柰酚-3-O-β- (f)鞣花酸 D-半乳糖苷?qǐng)D1 各化合物結(jié)構(gòu)

槲皮素、沒(méi)食子酸以及鞣花酸的抗氧化能力相當(dāng)，原因可能在于三者結(jié)構(gòu)中所具有的酚羥基的比例相當(dāng).槲皮素苷和山奈酚苷在結(jié)構(gòu)上的差別在于山柰酚苷比槲皮素苷在C環(huán)3′位上少了一個(gè)羥基，從而不難理解兩者抗氧化能力上的差異.

抗氧化能力槲皮素>槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷=槲皮素-3-O-β-半乳糖苷>山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷，可能是由于C環(huán)3位上的苷化降低了酚羥基在化合物中的比例，同時(shí)增大了空間位阻，減弱了其他酚羥基上氫的活性，從而使它對(duì)超氧自由基O2·的清除作用減弱[14,15].

3 結(jié)論

對(duì)水蓼中分離得到的化合物單體的體外抑菌和抗氧化活性研究表明，黃酮類(lèi)化合物有較好的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，同時(shí)具有非常顯著的抗氧化作用.首次從水蓼中分離得到的化合物也表現(xiàn)出一定的抑菌活性，且具有良好的抗氧化活性.彌補(bǔ)了秦嶺地區(qū)水蓼活性研究方面的不足，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用水蓼的藥用植物資源奠定了一定的理論基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯：陳 佳】

Antibacterial and antioxidant activity of the chemical compositions ofPolygonumhydropiperL.

MA Yang-min, LI Meng-yun, GUO Lin-xin, QIAO Ke , FAN Chao

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry, Ministry of Education, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

To study on the antibacterial activity of the 11 compounds isolated fromPolygonumhydropiperL. and some compounds′ antioxidant activity was measured by microdilution method on 96-well plates. The minimum inhibiting concentration (MIC) was used for evaluating the degree of antibacterial ability of each compound.The antioxidant capacity was measured by the DPPH radical-scavenging rate.The curves were plotted and the IC50of compounds was determined by using origin 70 software,with IC50expressing antioxidant capacity of different compounds.The results showed that the 11 compounds fromPolygonumhydropiperL. manifested different degree of antibacterial activity,and the flavonoids had good antibacterial effect,quercetin showed the best activity to restrain the growth of theStaphylococcusaureuswith MIC value of 31.3μg·mL-1.The compounds detected showed good antioxidant activity,and the antioxidant effect of quercetin, gallic acid and ellagic acid are better than vitamin C.Results indicate that these compounds isolated fromPolygonumhydropiperL. have good antibacterial and antioxidant activity.The different activity of flavonoids is because of their different structures.The more enol structure in the flavonoids,the stronger antioxidant capacity it has.

PolygonumhydropiperL.; chemical compounds; antibacterial activity; antioxidant activity; QSAR

2016-11-19

國(guó)家公益性行業(yè)(林業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(200904004)

馬養(yǎng)民(1963-)，男，陜西咸陽(yáng)人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)及有機(jī)合成

1000-5811(2017)01-0120-04

R932

A