基于鼠精細胞的味覺阻抗傳感器用于苦味物質檢測的研究

田玉蘭，蘇凱麒，邱先鑫，方佳如，秦 臻，李 蓉，王 平

（浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027）

基于鼠精細胞的味覺阻抗傳感器用于苦味物質檢測的研究

田玉蘭，蘇凱麒，邱先鑫，方佳如，秦 臻，李 蓉，王 平*

（浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027）

本文設計了一種基于雄鼠精細胞的細胞阻抗傳感器用于苦味物質的特異性檢測。雄鼠精細胞內含有大量T2Rs受體（G蛋白偶聯受體）可以對苦味物質產生特異性響應，苦味受體被苦味物質激活后產生的響應會引起細胞形態骨架的變化，從而可以被細胞阻抗傳感器檢測。本文探索了實驗的最佳細胞密度，檢測了苯硫脲和奎寧兩種常見的苦味物質的響應，苯硫脲檢測范圍為10 μmol/L～200 μmol/L，檢出限為4 μmol/L；奎寧檢測范圍為62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，檢出限為40 μmol/L。傳感器阻抗值增量與苦味物質濃度呈一定的線性相關性。此外，論文對該味覺傳感器的特異性進行了測試分析，表明了基于細胞傳感器的檢測方法為代替動物和人的苦味測試提供了一種可能的新的手段。

苦味檢測；細胞阻抗傳感器；精細胞

苦味識別是生物機體的一種防御機制，由于自然界中很多有毒物質都是苦的，對苦味的識別能有助于動物避免攝入有毒和有害物質，在動物長期進化過程中具有重要作用。因此苦味識別技術在食品安全，環境檢測及藥物篩選等方面具有重要價值。傳統的味覺傳感器，或稱電子舌［1］，其關鍵因素在于獲取靈敏度高和特異性好的敏感材料以達到在復雜環境下高效檢測的結果。然而傳統的敏感元件通常面臨靈敏度低，檢測種類有限的困難。因此仿生味覺傳感器中的細胞傳感器以其高度的生物特異性及靈敏度受到廣泛關注。但仿生傳感器存在受體細胞難以獲取和細胞與器件的耦合問題。

苦味受體細胞是表達有苦味受體的一類特殊的細胞，主要在口腔味蕾的受體細胞內表達［2-4］。同時，研究表明，在小鼠睪丸組織中也有大量的苦味受體基因的表達［5-8］。苦味受體是一類7次跨膜的G蛋白偶聯受體（GPCR）中的T2Rs家族（第二類味覺受體家族），對苦味物質具有高度特異性［6，9］。苦味受體被相應配體及激動劑激活后，通過特定信號轉導通路，產生細胞級聯反應，如細胞形態，生理及膜電位變化［3］。細胞阻抗傳感器是一種可以通過檢測電極之間的阻抗變化來反映生長在電極之上的細胞的形態變化的傳感器，具有長期無侵入監測細胞生長及形態變化的特點，研究表明阻抗傳感器可以檢測GPCR被激活后引起的細胞形態變化［10-11］。

基于以上論述，本文提出采用雄鼠精細胞作為味覺細胞傳感器的敏感材料，細胞阻抗傳感器作為二級傳感器來檢測苦味物質的方法，由于睪丸內存在大量游離的生殖細胞，因此作為構建細胞傳感器敏感單元的細胞源具有明顯優勢，并且相對于表達在異源系統的苦味受體細胞系，原代生殖細胞能對苦味產生更為特異的細胞響應。細胞阻抗傳感器用于苦味受體被激活后引起的細胞形態的變化。因此，利用雄鼠精細胞對苦味物質進行檢測，苦味物質引起精細胞的形態變化將被阻抗傳感器以阻抗的形式表現出來，從而實現對苦味物質的檢測。該方法靈敏度高，細胞易獲取且操作簡單，因此在代替動物和人進行苦味物質的檢測的方面具有廣泛應用的潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：HS培養液：135 NaCl，5 KCl，2 CaCl2， 1 MgCl2，30 HEPES（生物緩沖劑），10 glucose（葡萄糖），10 lactic acid（乳酸）和1 pyruvid acid（丙酮酸），單位 mmol/L，用 NaOH調節 pH至 7.4；5 mg/mL BSA溶液（稀釋液為HS溶液）；25%烏拉坦；Cell-Tak試劑（細胞粘合劑）；苯硫脲（PTC），奎寧（Quinine），苯甲地那銨（Dena），檸檬酸（CA），蔗糖（Suc），食鹽（NaCl），谷氨酸鈉（MSG），以上試劑均購買自阿拉丁。

儀器：手術剪，鑷子，均購買自上海醫療器械（集團）有限公司手術器械廠；22 μm過濾器，購買自Corning（New York，America）；超純水機，購買自中國香港力康（Heal Force）生物醫療科技控股有限公司；電子天平，購買自METTLER-TOLEDO（Zurich，Switzerland）。

1.2 系統檢測原理

細胞電極阻抗傳感，由 Giaever和 Keese在1984年首次提出，是一種可用于監測離體培養細胞行為的傳感器［12-13］。細胞在ECIS傳感器電極上的貼附、生長和死亡等可以改變電極的電場分布從而引起電阻抗的變化。傳感器通過檢測電極間的阻抗變化可以實時監測細胞貼附及細胞形態變化［14］。由于細胞阻抗傳感器具有無標記，非侵入，可定量，實時的優點，常用于監測細胞貼附及形態變化的實驗過程，檢測細胞生長，貼附及凋亡，在藥物篩選，細胞毒性觀測上有廣泛應用［15］。圖1為傳感器的檢測原理圖和檢測系統。

圖1 基于雄鼠精細胞的阻抗傳感器的檢測系統介紹

圖1A為8周左右的雄鼠經過麻醉后取雄鼠精細胞用于后續實驗。圖1B為傳感器檢測苦味物質濃度的檢測原理，精細胞貼附于叉指電極表面，當加入苦味物質時，由于苦味物質與苦味受體結合激活GPCR蛋白導致細胞形態的變化，該變化會反映到細胞-電極之間的電阻變化，通過阻抗即可表現出加入苦味物質濃度的變化。圖1C傳感器電路檢測系統原理示意圖：主要包括信號發生模塊、前置放大濾波模塊、模數轉換模塊和中央處理器模塊［16-17］。檢測系統通過信號發生模塊產生微小的正弦電壓信號，并將這個微小的電壓信號加載在多通道傳感器上，會在傳感器叉指電極上形成離子電流，傳感器輸出電流經過放大和濾波模塊，被數模轉換模塊采集，最后通過激勵信號的幅值和輸出電流的幅值，即可計算出每個通道的阻抗大小。圖1D為本實驗室的16通道檢測儀器及阻抗板的實物。圖1E為上位機測量系統，用于實時顯示阻抗的變化。

在利用阻抗對細胞狀態進行測量時，常使用細胞指數來表征細胞的狀態［18-19］，其中細胞指數與阻抗之間的關系如下：

式中，CIk(t)表示k通道的細胞在t時刻的細胞指數，Zk(t)表示k通道在t時刻的阻抗值，Zk(0)為k通道檢測的初始點的阻抗值，Zk為k通道的腔內阻抗值，為了進一步檢測苦味物質的濃度變化對細胞的影響，我們引入歸一化細胞指數的概念，歸一化細胞指數與細胞指數的關系如下：

式中，NCIk(t)表示k通道的歸一化細胞指數，CIk(t)表示k通道的t時刻的細胞指數，CIk(tn)表示k通道歸一化點tn的細胞指數值。

利用NCIk(t)的值隨不同溶液濃度的變化而變化即可以檢測所加溶液的濃度。

1.3 方法

1.3.1 阻抗板的包被

阻抗板用Cell-Tak溶液包被，放置于4℃環境下過夜或者37℃環境下放置1 h，實驗前吸干殘余液，晾干阻抗板，備用。

1.3.2 雄鼠精細胞提取

手術剪消毒；選用一只8周左右的野生型的雄鼠，用25%烏拉坦腹腔注射麻醉；用鑷子及手術剪取出兩側睪丸，去除脂肪墊、白膜及血管，將曲細精管置于HS溶液中；用HS溶液將曲細精管吹打洗滌3次使其分散以及除去血細胞和間質細胞；用鑷子將曲細精管剪碎呈半液體狀態，置于含有5 mg/mL BSA（bovine serum albumin）的HS培養液中；用吸管反復吹打組織碎片，用過濾網除去組織碎片，分離精細胞；700 r/min離心1 min，將包含大量精細胞的上清液分離出來；稀釋20倍后計數，細胞溶液用培養基稀釋至400萬個/mL；將所得精細胞溶液接種在2個8孔阻抗板中，每孔180 μL；將接種后的兩板細胞載入EICS-16系統中，放置于37℃的培養箱中開始檢測；120 min（阻抗信號平穩）后加藥進行檢測。

1.3.3 細胞密度探索

我們對不同細胞密度下精細胞阻抗傳感器的靈敏度進行了探索，分別測試了在10萬個/mL、50萬個/mL、100萬個/mL、200萬個/mL、400萬個/mL、600萬個/mL的細胞密度下傳感器對200 μmol/L的苯硫脲（PTC）的響應。

1.3.4 苦味物質濃度的測試

奎寧：使用HS緩沖液配制濃度為5 μmol/L，20 μmol/L，62.5 μmol/L，125 μmol/L，250 μmol/L，500 μmol/L，1 000 μmol/L，2 000 μmol/L的奎寧溶液，待傳感器細胞阻抗平穩后加入不同濃度溶液，每個濃度做四組實驗。

PTC：使用HS緩沖液配制濃度為0.4 μmol/L，2 μmol/L，10 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L，1 000 μmol/L，2 000 μmol/L的PTC溶液，待傳感器細胞阻抗平穩后加入不同濃度溶液，每個濃度做四組實驗。

1.3.5 特異性測試

為了考察傳感器對于苦味物質的特異性，我們分別檢測了雄鼠精細胞阻抗傳感器對1 000 μmol/L的苯甲地那銨（Dena），檸檬酸（CA），蔗糖（Suc），食鹽（NaCl），谷氨酸鈉（MSG）以及HS溶液的響應。

2 結果與討論

2.1 密度探索結果分析

圖2（a）為不同細胞密度下雄鼠精細胞在阻抗板上面的貼附情況圖，圖2（b）為不同細胞密度下傳感器對 200 μmol/L的 PTC溶液的阻抗響應曲線。

由圖2（a）可看出細胞貼附數量隨著加入溶液的細胞密度的增加而增加，當細胞濃度在10萬個/mL到400萬個/mL之間時，其貼附數量逐漸增加，到400萬個/mL時基本上整個金電極表面幾乎都有細胞貼附，600萬個/mL與400萬個/mL濃度下細胞的貼附數量無太大變化，其細胞貼附面積與每孔電極面積的比值分別為1%、10%、40%、75%、95%和96%。圖2（b）表明對于濃度為200 μmol/L的PTC溶液，不同細胞濃度下傳感器的響應幅度存在差異，當細胞種植密度在400萬個/mL以下時，其響應幅度隨著細胞密度的增加而增加，當細胞種植密度大于400萬個/mL時，其響應與400萬個/mL相比無明顯增加，因為當細胞種植密度在400萬個/mL左右時，精細胞幾乎在整個金電極表面均有貼附，再增加種植密度，貼附細胞數量并不會顯著增加。可因此我們選擇400萬個/mL作為實驗時的細胞溶度。

圖2 貼附情況和阻抗響應曲線

2.2 苦味物質測試結果分析

圖3（a）為精細胞阻抗傳感器對不同濃度PTC溶液的實時響應曲線，右圖為細胞-電極阻抗變化值與奎寧濃度之間的擬合關系（mean±SD，n=4）其中mean為平均值，SD為標準差，n為實驗次數，右圖表明PTC的濃度響應在10 μmol/L～200 μmol/L內呈線性關系，其線性方程為y=0.11x-0.07，線性相關系數為0.95。檢測限通過計算空白響應標準差的3倍計算得出，大小為4 μmol/L。

圖4（a）為精細胞阻抗傳感器對不同濃度奎寧溶液的實時響應曲線，右圖為細胞-電極阻抗變化值與奎寧濃度之間的擬合關系（mean±SD，n=4），圖4（b）表明奎寧的濃度響應在67.5 μmol/L～1 000 μmol/L內呈線性關系，其線性方程為y=0.05x-0.09，線性相關系數為0.96。檢測限通過計算空白響應標準差的3倍計算得出，大小為40 μmol/L。

圖3 苦味PTC阻抗響應曲線及其標準曲線

圖4 苦味奎寧阻抗響應曲線及其標準曲線

2.3 系統特異性分析

為了考察傳感器對于苦味物質的特異性，我們分別檢測了該傳感器對1 000 μmol/L的Dena，CA，Suc，NaCl，MSG以及Buffer溶液的響應，結果如圖5所示。圖5為數據進行Student’st檢驗，可以得出傳感器對Quin的響應顯著高于其他幾種味覺化合物（P＜0.05）。這是因為精原細胞中有大量的苦味受體蛋白的表達，因此精細胞對苦味物質的響應具有特異性，而精細胞內沒有其他幾種味道的受體，因此對其他物質的響應很小。

圖5 阻抗響應曲線和特異性檢測分析結果

3 結論

本文構建了一種基于鼠精細胞的阻抗傳感器用于苦味物質的特異性檢測。該方法結合了雄鼠精細胞對苦味物質具有特異性響應和細胞阻抗傳感器實時無侵入測量細胞生長、貼附、形態變化的特點，提出了一種檢測苦味物質的新方法。我們探索了使細胞貼附在電極上的方法，實驗最佳細胞密度。實驗結果表明，該方法對PTC線性檢測濃度范圍為10 μmol/L～200 μmol/L，檢測限為4 μmol/L；奎寧檢測范圍為線性62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，檢測限為40 μmol/L。此外，通過檢測傳感器對其他不同味覺物質的響應，表明這種方法對苦味物質具有特異性的響應。與傳統的味覺傳感器比較，該方法具有靈敏度高、特異性好、并且細胞易獲取的優點，此外，采用的仿生細胞傳感器的檢測方法在代替動物和人實現苦味物質的檢測方面具有廣泛應用的前景。

［1］裘姍姍，王俊.電子鼻與電子舌融合技術在食品品質檢測中的應用［J］.2014，

［2］Wong G T，Gannon K S，Margolskee R F.Transduction of Bitter and Sweet Taste by Gustducin［J］.1996，

［3］Chandrashekar J，Mueller K L，Hoon M A，et al.T2Rs Function as Bitter Taste Receptors［J］.Cell，2000，100（6）：703-711.

［4］Adler E，Hoon M A，Mueller K L，et al.A Novel Family of Mammalian Taste Receptors［J］.Cell，2000，100（6）：693-702.

［5］H?fer D，Asan E，Drenckhahn D.Chemosensory Perception in the Gut［J］.Physiology，1999，14（1）：18-23.

［6］Wu S V，Rozengurt N，Yang M，et al.Expression of Bitter Taste Receptors of the T2R Family in the Gastrointestinal Tract and Enteroendocrine STC-1 Cells［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2002，99（4）：2392-2397.

［7］Xu J，Cao J，Iguchi N，et al.Functional Characterization of Bitter-Taste Receptors Expressed in Mammalian Testis［J］.Molecular Human Reproduction，2013，19（1）：17-28.

［8］Li F，Zhou M.Depletion of Bitter Taste Transduction Leads to Massive Spermatid Loss in Transgenic Mice［J］.Molecular Human Reproduction，2012，18（6）：289-297.

［9］Hu L，Xu J，Qin Z，et al.Detection of Bitterness in Vitro by a Novel Male Mouse Germ Cell-Based Biosensor［J］.Sensors and Actuators B：Chemical，2016，223（ ）461-469.

［10］Kammermann M，Denelavas A，Imbach A，et al.Impedance Measurement：A New Method to Detect Ligand-Biased Receptor Signaling［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，412（3）：419-424.

［11］Scandroglio P，Brusa R，Lozza G，et al.Evaluation of Cannabinoid Receptor 2 and Metabotropic Glutamate Receptor 1 Functional Responses Using a Cell Impedance-Based Technology［J］.Journal of Biomolecular Screening，2010，15（10）：1238-1247.

［12］Ghosh P M，Keese C R，Giaever I.Morphological Response of Mammalian Cells to Pulsed AC Fields［J］.Bioelectrochemistry and Bioenergetics，1994，33（2）：121-133.

［13］Giaever I，Keese C.Monitoring Fibroblast Behavior in Tissue Culture with an Applied Electric Field［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1984，81（12）：3761-3164.

［14］Xiao C，Lachance B，Sunahara G，et al.An In-Depth Analysis of Electric Cell-Substrate Impedance Sensing to Study the Attachment and Spreading of Mammalian Cells［J］.Analytical Chemistry，2002，74（6）：1333-1339.

［15］Asphahani F，Wang K，Thein M，et al.Single-Cell Bioelectrical Impedance Platform for Monitoring Cellular Response to Drug Treatment［J］.Physical Biology，2011，8（1）：015006.

［16］蘇凱麒，鄒玲，王琴，等.基于細胞阻抗傳感器的腹瀉性毒素檢測系統設計與實現［J］.傳感技術學報，2014，27（3）：283-288.

［17］王天星，黎洪波，蘇凱麒，等.基于細胞電阻抗傳感器的細胞多生理參數分析系統設計［J］.傳感技術學報，2014，27（12）：1589-1595.

［18］Abassi Y A，Jackson J A，Zhu J，et al.Label-Free，Real-Time Monitoring of IgE-Mediated Mast Cell Activation on Microelectronic Cell Sensor Arrays［J］.Journal of Immunological Methods，2004，292（1）：195-205.

［19］Abassi Y A，Xi B，Zhang W，et al.Kinetic Cell-Based Morpholog ical Screening：Prediction of Mechanism of Compound Action and Off-Target Effects［J］.Chemistry&biology，2009，16（7）：712-23.

田玉蘭（1990.04），女，浙江大學生物醫學工程2014級碩士研究生，從事生物醫學工程與生物醫學傳感器研究，cnyltian@ zju.edu.cn；

王 平（1962-），男，浙江大學，教授，博士生導師，主要研究方向為傳感器與檢測技術、生物芯片與生物電子學、人工嗅覺與人工味覺等，cnpwang@zju.edu.cn。

A Study on Mouse Germ Cell-Based Sensor for the Detection of Bitterness

TIAN Yulan，SU Kaiqi，QIU Xianxin，FANG Jiaru，QIN Zheng，LI Rong，WANG Ping*
（Biosensor National Special Laboratory，Key Laboratory for Biomedical Engineering，Ministry of Education，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou310027，China）

In this study，the feasibility of utilizing male mouse germ cells in testis and electrical cell-substrate impedance sensor（ECIS）was explored to build a cell-based bitter biosensor，which can sensitively and specifically respond to bitter compounds.Male mouse germ cells express lots of bitter receptor T2Rs（G protein coupled receptors）which can sensitively and specifically respond to bitter compounds，when active by ligands will affect cell morphology in a specific manner.The best cell density was explored；cell-impedance response profiles of germ cells to two bitter compounds were investigated by analyzing the response intensity under various concentrations，The linear detection range of PTC is 10 μmol/L～200 μmol/L，the detection limit is 4 μmol/L；the linear detection range of quinine is 62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，the detection limit is 4 μmol/L； Furthermore，impedance responses to five basic tastes were examined to evaluate the specificity of cell-based bitter biosensor in bitter detection.The results revealed that this hybrid bitter biosensor could respond to those bitter compounds in a dose-dependent manner.And it could respond to bitter compounds specifically.This biosensor may provide a promising approach for detecting various bitter compounds.

biosensor；bitter taste receptor；electrical cell-substrate impedance sensor；male mouse germ cells

R318

A

1004-1699（2016）12-1785-06

??7230J

10.3969/j.issn.1004-1699.2016.12.001

2016-04-25修改日期：2016-07-18