螯合Cy5-AMT-SPIONs雙模探針在急性顳葉癲癇模型中的靶向定位

王艷麗， 孔慶霞, 鄭 戈

?

螯合Cy5-AMT-SPIONs雙模探針在急性顳葉癲癇模型中的靶向定位

王艷麗1， 孔慶霞2, 鄭 戈3

目的 探討螯合Cy5-AMT-SPIONs雙模探針在氯化鋰-皮羅卡品誘導急性顳葉癲癇模型病灶中的靶向定位作用。方法 將30只急性顳葉癲癇大鼠隨機平均分為超順氧化鐵磁性納米粒子組(SPIONs組)、Cy5標記的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5-SPIONs組)、Cy5標記的α-甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5-AMT-SPIONs組)。各組分別于注射藥物前、注射后4 h行同參數MR T2序列和T2map序列并使用T2mapping軟件測量T2值。行普魯士藍染色觀察鐵粒子在海馬區的分布，在激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5在大腦中的分布，行免疫熒光染色觀察星形膠質細胞增生情況，行尼氏染色觀察神經元缺失情況。結果 SPIONs組T2信號稍下降，Cy5-SPIONs組T2信號稍下降，Cy5-AMT-SPIONs組T2信號明顯下降。普魯士藍染色觀察鐵離子在海馬區的分布，可見藍棕色顆粒分布，主要分布在細胞漿內，Cy5-AMT-SPIONs組相對其他兩組有明顯差異。激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5熒光分布各組間有明顯差異。免疫熒光法各組均可見星形膠質細胞增生，各組無明顯差異。尼氏染色各組均可見神經元缺失情況，各組無明顯差異。結論 Cy5-AMT-SPIONs雙模探針對癲癇有精確靶向定位作用且對腦組織無明顯毒害作用。

顳葉癲癇； Cy5； α-甲基色氨酸； 超順氧化鐵磁性納米粒子； 雙模探針

顳葉癲癇是最常見的難治性癲癇之一，藥物治療往往效果不理想，手術治療成為主要的治療手段，而難治性癲癇病灶的精確定位是手術治療的關鍵之一。α-甲基色氨酸(alpha-methyl-L-tryptophan，AMT)是一種合成的氨基酸，有研究表明其可對癲癇病灶起到主動靶向定位作用，國外Akhtari等[1]首次將AMT與MRI結合用于致癇灶定位研究，發現一種新型的fMRI方法。我們課題組前期實驗[2]證實AMT的靶向定位，并探討了其最佳掃描時間。Cy5.5作為熒光染料的代表，具有在近紅外區域的最低吸收光譜，并可以深入患病組織[3]。Cy5是近紅外區的染料分子，作為一種熒光探針分子具有超靈敏成像的優點。本實驗以AMT作為探針的導向部分，通過將其與Fe3O4超順磁性納米顆粒和熒光染料Cy5 耦聯，構建具有核磁/光學雙模態成像功能的癲癇病灶特異性分子影像探針，開展體內成像實驗，為提高癲癇病灶早期診斷的準確率和特異性提供了分子影像學和光學支持。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 磁性納米粒子 超順氧化鐵磁性納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)、Cy5標記的超順氧化鐵磁性納米粒子(Cy5-SPIONs)、Cy5標記的α-甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子(Cy5-AMT-SPIONs)(南京東納公司)。

1.1.2 其他實驗材料 實驗動物健康雄性Sprague Dawley大鼠(山東魯抗實驗動物中心，生產許可證scxk魯20140007)，3.0T超導型MR掃描儀(德國西門子)，激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)，恒冷切片機(德國Leica公司)、氯化鋰、匹羅卡品、甲基化阿托品(美國Sigma)，抗GFAP一抗、cy3 標記標記驢抗兔二抗(英國Abcam)，水合氯醛、普魯士藍試劑盒(北京索萊寶公司科技有限公司)，甲苯胺藍染色(江蘇碧云天生物技術有限公司)，生理鹽水(山東魯抗醫藥股份有限公司)，無水乙醇、甲醇、氯化鈉、多聚甲醛等實驗室常用藥品(山東省萊陽市鐵塔化工用品廠)等。

1.2 實驗動物顳葉癲癇模型制作 選擇健康雄性Sprague Dawley大鼠40只，體重200～250 g，環境為清潔級，溫度維持在20 ℃，分籠飼養，飼以標準飼料，自由飲水，固定12 h人工晝夜循環的環境。采用氯化鋰-皮羅卡品誘導急性顳葉癲癇模型。具體方法如下：SD大鼠第1天提前18～24 h 腹腔注射氯化鋰(LiCl) 127 mg/kg;第2天提前30 min腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg /kg，30 min后實驗組腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品30 mg/kg，按照Racine 癲癇行為標準觀察記錄大鼠行為30 min，若大鼠未達到Racine 分級的Ⅳ～Ⅴ級的癇性發作，繼續追加匹羅卡品的劑量，每隔10 min重復注射匹羅卡品一次，每次為10 mg/kg，最大追加劑量可達60 mg/kg。發作級別達Racine 分級Ⅳ～ Ⅴ級，發作持續1 h以上視為成功的顳葉癲癇模型。

1.3 分組 在造模成功且存活的顳葉癲癇模型中，按照隨機數字表法隨機挑選出30只大鼠進行急性期實驗，共分為3組，每組10只，各組分別為：第1組:超順氧化鐵磁性納米粒子組(SPIONs組)；第2組：Cy5標記的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5- SPIONs組)；第3組：Cy5標記的α-甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5- AMT-SPIONs組)。

1.4 磁共振掃描及藥物注射 首先腹腔注射水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 mg)誘導麻醉，觀察處于麻醉狀態后，水平趴在3英寸線圈上方并固定，使線圈的中心與大鼠體部及磁場的中心保持一致。采用西門子3.0T超導型MR掃描儀，行同參數MR T2序列和T2map序列,掃描序列為：T2sequences，2500 TR/TE 70，FOV 80 mm，層厚2.0 mm，片層12，掃描時間7.20 min。使用T2mapping軟件測量致癇灶局部組織的信號強度T2值。掃描時盡量使掃描定位一致，保持圖像對比的一致性，各組SD大鼠選擇癲癇發作后48 h進行尾靜脈藥物注射，于注射藥物前和后4 h分別進行磁共振掃描。

1.5 病理組織學檢查

1.5.1 腦組織取材 磁共振掃描完畢后立即進行心臟灌注后取腦組織，首先麻醉、固定，依次以0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛經心臟灌注固定，分離腦組織置于4%的多聚甲醛4 ℃過夜固定，后放入30%的蔗糖溶液中4 ℃浸泡至組織塊沉底，后行與MRI致癲灶位置吻合的位置連續冠狀冰凍切片，-80 ℃保存備用于組織染色。

1.5.2 普魯士藍染色 冰凍切片4 ℃復溫30 min后涼干，蒸餾水沖洗2 min；入Perls,stain，浸染15～30 min；蒸餾水沖洗2～5 min；入核固紅染色液5～10 min；自來水沖洗1～5 s；常規脫水，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡觀察行圖像采集。

1.5.3 DAPI染色激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5在大腦中的分布情況 將冰凍切片4 ℃復溫30 min，加5%山羊血清封閉2 h， DAPI孵育染核10 min，室溫避光；PBS洗滌3次，每次10 min；抗熒光衰減封片劑封片，采用激光共聚焦顯微鏡進行圖像采集。

1.5.4 免疫熒光染色 將冰凍切片4 ℃復溫30 min，加5%山羊血清封閉2 h，加入抗GFAP一抗4 ℃ 孵育16 h，PBS洗滌3次，每次10 min；加入cy3標記驢抗兔二抗，避光室溫條件孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min；DAPI孵育染核10 min，室溫避光；PBS洗滌3次，每次10 min；抗熒光衰減封片劑封片，采用激光共聚焦顯微鏡進行圖像采集。

1.5.5 尼氏染色 冰凍切片4 ℃復溫30 min后涼干，PBS洗滌3次，每次10 min； 60 ℃的0.5%甲苯胺藍水溶液染色5～10 min；蒸餾水沖洗；70%酒精浸泡2 min；95%酒精中分色；梯度脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡進行圖像采集。

2 結 果

2.1 造模情況 SD大鼠腹腔注射匹羅卡品10 min后開始出現排便排尿、軀體抖動、行動刻板等，直至最終出現全身強直-陣攣癲癇大發作，待發作持續1 h以上后給予水合氯醛終止發作，并加強呼吸道護理，給予葡萄糖、奶粉能量支持，降低死亡率。造模成功率為80%(40只大鼠，35只成功建立急性期模型，后死亡3只，存活32只)，從成功癲癇模型中隨機選擇30只癲癇大鼠用于實驗研究。

2.2 磁共振掃描 急性期MRI顯示T2序列雙側顳葉海馬高信號病灶，給藥前3組致癇灶T2信號無明顯差異，無統計學意義(P>0.05)，組1、組2注射藥物前后經比較T2信號無明顯差異，無統計學意義(P>0.05)，組3 注射藥物后T2信號明顯降低，T2map值顯著下降，有統計學意義(P<0.05) (見圖1、表1)。

2.3 大鼠腦組織病理組織染色結果

2.3.1 普魯士藍染色觀察鐵粒子在海馬區的分布情況 3組鏡下均可見藍棕色顆粒分布，主要分布在細胞漿內。其中組3鐵粒子分布較多，相對組1、組2鐵粒子分布有明顯差異，有統計學意義(P<0.05) ，組2相對組1鐵粒子分布無明顯差異，無統計學意義(P>0.05)(見圖2、表2)。

2.3.2 在激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5熒光分子在在大腦中的分布情況 可見組1無Cy5分布，組2、組3均有Cy5的分布，各組Cy5分布兩兩相比較有明顯差異，有統計學意義(P<0.05) (見圖3、表3)。

2.3.3 在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組星形膠質細胞增生情況 各組均可見星形膠質細胞增生，各組間兩兩相比較無明顯差異，無統計學意義(P>0.05)(見圖4、表4)。

2.3.4 尼氏染色觀察各組海馬神經元缺失情況 尼氏染色鏡下可見，各組大鼠海馬CA1、CA3區大量神經元缺失，空泡樣變性，神經元形態異常，呈三角形或不規則形態，細胞排列紊亂，胞核與胞漿分界不清,各組相比較無明顯差異，無統計學意義(P>0.05)(見圖5、表5)。

表1 3 組癲癇模型大鼠MRI T2map值

給藥后與給藥前比較*P>0.05

表2 3組癲癇模型大鼠普魯士藍鐵粒子數目±s)

組1與組2分別與組3比較*P<0.05

表3 3 組癲癇模型大鼠Cy5數目

3組間兩兩比較P<0.05

表4 3組癲癇大鼠星形膠質細胞數目 ±s)

3組間兩兩比較P>0.05

表5 3組癲癇大鼠神經元數目 ±s)

3組間兩兩比較P>0.05

3 討 論

血腦屏障在發揮中樞神經系統保護作用的同時也阻礙了診斷和治療藥物向腦部的遞送[4]。超順磁性Fe3O4納米顆粒由于粒徑小、比表面積大、磁性強、制備工藝簡單，同時又對人體不產生毒副作用、無免疫原性、可隨人體代謝排除體外、易穿過各種生理屏障到達指定部位，使其廣泛應用[5]。最近納米粒子的發展促使各種磁性納米粒子的設計及合成，研究表明納米粒子在組織中以依賴濃度的方式改變了周圍質子的磁環境并改變T1和/或T2信號[6]。α-甲基色氨酸是色氨酸的類似物，在癲癇灶中具有高攝取的特點[7]。小分子熒光探針由于具有良好的光學性能和優異的生物相容性使得其口服給藥已廣泛應用于生物醫學領域[8]。本實驗制備Cy5標記的α甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子，構建具有核磁/光學雙模態成像分子影像探針。我們比較說明SPIONs、Cy5-SPIONs、Cy5-AMT-SPIONs在磁共振上的成像，發現注射Cy5-AMT-SPIONs前后磁共振T2相信號下降明顯，注射Cy5-SPIONs、SPIONs前后磁共振T2相信號變化不明顯，證實AMT的主動靶向定位作用，我們課題組前期也已經證明了α-甲基色氨酸對癲癇的靶向定位價值，且證明超順磁性納米粒子可以降低T2信號，因為本實驗研究中注射劑量為4 mg/kg，相比課題組先前注射的15 mg/kg[2]，鐵離子劑量明顯減少，推測T2相信號的下降或許與鐵離子劑量相關，下一步應繼續探討鐵離子劑量對磁共振成像的影響。靶向模式分為被動靶向和主動靶向，其中Fe3O4納米粒子基本上是通過組織器官對Fe3O4納米粒子的攝取來實現的，屬于被動靶向模式。Fe3O4納米粒子的外殼包被材料如果裝配上特異性配體分子抗體、小分子配體、多肽配體等，借助于受體-配體的特異性結合作用，使得Fe3O4納米粒子與體內組織或器官的特異性表面受體結合，達到對特定的靶細胞組織和器官進行對比增強成像的目的，從而進一步提高病灶的檢出率此時即為主動靶向模式。普魯士藍染色比較各組鐵粒子的分布可見注射SPIONs、Cy5-SPIONs、Cy5-AMT- SPIONs海馬區均有鐵粒子分布，注射Cy5-AMT- SPIONs組相對其他兩組有顯著差異，在組織學上再次證明AMT對超順磁性納米粒子的主動靶向作用。激光共聚焦顯微鏡下觀察各組Cy5在大腦中的分布，注射Cy5-SPIONs組Cy5在大腦病灶中有分布，表明Cy5可以通過超順磁性納米粒子進行被動靶向到致癇灶，注射Cy5-AMT-SPIONs組Cy5在大腦病灶中有分布，相對Cy5-SPIONs組大腦中Cy5分布較多，有統計學差異(P<0.05)，進一步證明了AMT對熒光分子有主動靶向作用，證實在AMT的主動靶向作用下Cy5可深入致癇灶組織。免疫熒光觀察星形膠質細胞、尼氏染色觀察神經元情況，各組無明顯差異，表明Cy5標記的α-甲基色氨酸的磁性納米粒子雙模探針在急性顳葉癲癇模型精確定位是安全的，但是未進行相關的毒理學實驗。本實驗研究表明Cy5標記的α-甲基色氨酸的磁性納米粒子能特異性定位急性癲癇模型致癇灶，達到解剖定位與功能定位一致的精確定位作用。本實驗構建具有核磁/光學雙模態成像功能的癲癇病灶特異性分子影像探針，開展體內成像實驗，為提高癲癇病灶早期診斷的準確率和特異性提供分子影像學和光學支持。下一步需繼續探討不同劑量鐵離子及不同劑量熒光分子對核磁/光學雙模態成向的影響。

[1]Akhtari M,Bragin A,Moats R,et al.Imaging brain neuronal activity using functionalized magnetonanoparticles and MRI[J].Brain Topogr,2012,25(4):374-388.

[2]付婷婷,孔慶霞,盛華強,等.靶向磁性納米粒子用于急性顳葉癲癇的MRI研究[J].Apoplexy Nervous Dis,2015,32(8):722-725.

[3]Ke S,Wen X,Gurfinkel M,et al.Near-infrared optical imaging of epidermal growth factor receptor in breast cancer xenografts[J].Cancer Res,2003,63(22):7870-7875.

[4]Corot C,Robert P,Idee JM,et al.Recent advances in iron oxide nanocrystal technology for medical imaging[J].Adv Drug Deliv Rev,2006,58(14):1471-1504.

[5]Mc Carthy J,Weissleder R.Multifunctional magnetic nanoparticles for targeted imaging and therapy[J].Adv Drug Deliv Rev,2008,60(11):1241-1251.

[6]Islam T,Harisinghani MG.Overview of nanoparticle use in cancer imaging[J].Cancer Biomark,2009,5(2):61-67.

[7]Massoud A,Anatol B,Mark C,et al.Functionalized magnetonanoparticles for MRI diagnosis and localization in epilepsy[J].Epilepsia,2008,49(8):1419-1430.

[8]Luo S,Zhang E,Su Y,et al.A review of NIR dyes in cancer targeting and imaging[J].Biomaterials,2011,32(29):7127-7138.

圖1 各組磁共振掃描圖像 注：圖A1～D1為組1；圖A2～D2為組2；圖A3～D3為組3。圖A1～A3、C1～C3為各組注射藥物前后MR T2序列相；圖B1～B3、D1～D3為各組注射藥物前后T2map 序列相，箭頭所指為組3給藥后T2信號明顯下降

圖2 各組普魯士藍染色情況 注：A為組1，B為組2，C為組3，箭頭所指為鐵粒子的分布(×400倍)

圖3 各組Cy5在大腦中的分布情況 注：A為組1，B為組2，C為組3，箭頭所指為Cy5的分布(×200倍)

圖4 星形膠質細胞增生情況 注：可見星形角質細胞增生(×200倍);圖5 海馬組織尼氏染色情況 注：可見神經元缺失，空泡樣變性，神經元形態異常，呈三角形或不規則形態，排列紊亂，胞核與胞漿分界不清(×400倍)

The target location of chelating Cy5-AMT-SPIONs dual-mode probe in acute temporal lobe epilepsy model

WANGYanli，KONGQingxi,ZHENGge.

(GraduateSchool，TianjinMedicalUniversity，Tianjin300070，China)

Objective To investigate the target location by the action of chelating Cy5 labeled alpha-methyl-L-tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles dual-mode probe on lithium chloride-Piluoka induced acute temporal lobe epilepcy model.Methods Thirty temporal lobe epilepsy rats were randomly and evenly assigned to superparamagnetic iron oxide nanoparticles group,Cy5 labeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles group,Cy5 labeled alpha methyl tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles group.Each group was prior to drug injection,injection after 4 h,with parameters MR T2weighted images and T2map sequence and we used T2mapping software to measure the T2value.Perl，iron stain was used to observe the iron distribution in the hippocampus.We used laser scanning confocal microscope to observe the distribution of Cy5 in the brain.Immunofluorescence staining was used to observe the astrocyte proliferation,Nissl staining was used to observe the neuronal loss situation.Results T2signal of the superparamagnetic iron oxide nanoparticles group decreased slightly,T2signal of Cy5 labeled sup superparamagnetic iron oxide nanoparticles group decreased slightly,Cy5 labeled alpha methyl tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles group decreased significantly.The iron was mainly distributed in the cytoplasm.The Cy5-AMT-SPIONs group was significantly different from the other groups in the distribution of iron in the hippocampus area by Prussian blue staining.Laser scanning confocal microscope observation groups Cy5 fluorescence distribution had obvious differences.Immunofluorescence observed were visible astrogliosis.There was no significant difference between the groups.Nissl staining of groups were visible neuron loss groups.There was no significant difference between the groups.Conclusion Cy5 labeled alpha methyl tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles dual-mode probe had an impact on precise targeting positioning function of epilepsy and had no obvious toxic effect on the brain tissue.

Temporal lobe epilepsy; Cy5; Alpha-methyl-L-tryptophan; Superparamagnetic iron oxide nanoparticles; Dual-mode probe

1003-2754(2016)12-1072-04

2016-08-12；

2016-09-30 基金項目：國家自然科學基金面上項目(No.81371423) 作者單位：(1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.濟寧醫學院附屬醫院神經內科，山東 濟寧 272000；3吉林大學第二醫院肝膽胰外科，吉林 長春 130041) 通訊作者：孔慶霞，E-mail：kqx1970@aliyun.com

R742.1

A