馬爾尼菲青霉菌鑒定要點(diǎn)及該菌酵母相體外藥敏分析

謝良伊,王 娟,張 景,程振波,李 浩,梁 劍,鄭淑娟,曾 玲,鄧中華

(湖南省人民醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410005)

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馬爾尼菲青霉菌鑒定要點(diǎn)及該菌酵母相體外藥敏分析

謝良伊,王 娟,張 景,程振波,李 浩,梁 劍,鄭淑娟,曾 玲,鄧中華

(湖南省人民醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410005)

目的 了解馬爾尼菲青霉菌(PM)鑒定要點(diǎn)及該菌酵母相體外藥敏結(jié)果，以指導(dǎo)臨床合理用藥。方法收集某院2009—2016年23例PM感染患者血或骨髓的分離株，觀察其菌落形態(tài)，采用E-test法分析酵母相PM對(duì)伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、氟康唑的藥物敏感性。結(jié)果PM形態(tài)：組織標(biāo)本瑞氏染色直接鏡檢，可見(jiàn)典型卵圓形或圓形有明顯橫隔的孢子，常位于巨噬細(xì)胞內(nèi)；血培養(yǎng)標(biāo)本革蘭染色鏡檢，可見(jiàn)菌體兩端鈍圓略彎曲呈臘腸樣，偶有分枝狀，可見(jiàn)有橫隔。PM為雙相型真菌，28°C為菌絲相，產(chǎn)生紅色色素?cái)U(kuò)散入培養(yǎng)基中；35°C為酵母相，并有各自典型的菌落形態(tài)特征。伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、氟康唑?qū)湍赶?35°C)PM的最低抑菌濃度(MIC)范圍分別為0.002～0.016、0.012～0.125、0.002～0.500、0.500～16.000 μg/mL。結(jié)論P(yáng)M的特征性菌落形態(tài)，以及骨髓和外周血發(fā)現(xiàn)的真菌孢子對(duì)該菌有診斷價(jià)值。該菌對(duì)伊曲康唑敏感性最強(qiáng)，其次是伏立康唑、兩性霉素B，而氟康唑敏感性相對(duì)較弱。

馬爾尼菲青霉病； 馬爾尼菲青霉菌； 雙相型； 抗藥性，微生物； 耐藥性； 真菌

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：934-938]

馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei，PM)屬于青霉菌屬，是青霉菌屬中唯一的溫度依賴(lài)性雙相菌[1-2]，既能像大多數(shù)真菌一樣在常溫(30℃以下)腐物寄生，也能在較高溫度(35℃)環(huán)境中生長(zhǎng)。馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei，PSM)病情發(fā)展快，若不及時(shí)治療，病死率極高。隨著人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染者日益增多，PSM的發(fā)病率也逐漸增高，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)對(duì)本病提高認(rèn)識(shí)，做到早診斷、早治療。為防止PM漏檢，臨床上出現(xiàn)不明原因發(fā)熱及肝脾、淋巴結(jié)大時(shí)，應(yīng)考慮PM感染，并及時(shí)留取標(biāo)本進(jìn)行涂片檢查和真菌培養(yǎng)。近年來(lái)，一些抗原抗體檢測(cè)及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等快速診斷PM感染的方法相繼興起，但因特異性差，且缺乏大樣本研究，還未能進(jìn)行臨床推廣應(yīng)用，診斷仍以PM培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦應(yīng)用E-test法對(duì)雙相真菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，該方法操作簡(jiǎn)便，可反映不同抗真菌藥物對(duì)雙相PM的體外抗菌活性。但由于國(guó)際上無(wú)雙相型真菌的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，建立一個(gè)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確及重復(fù)性好的藥敏試驗(yàn)顯得尤為重要。本研究分析某院分離的PM，觀察其菌落形態(tài)，分析酵母相PM的體外藥敏結(jié)果，以指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 來(lái)自某院2009—2016年23例PM感染患者血或骨髓的分離株。

1.1.2 培養(yǎng)基 沙保羅瓊脂平板購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，真菌藥敏培養(yǎng)基購(gòu)自江門(mén)市凱林貿(mào)易有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)藥物 E-test抗真菌試紙條購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司，包括伊曲康唑(itraconazole，It)、伏立康唑 (voriconazole，Vo)、兩性霉素B(amphotericin，Ap)、氟康唑(fluconazole，F(xiàn)l)4種藥物，除氟康唑起始濃度為256 μg/mL外，其余3種藥物均為32 μg/mL。終末濃度均為0.002 μg/mL。

1.1.4 儀器 BacT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀、麥?zhǔn)媳葷醿x均為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集患者血5～10 mL或骨髓2～3mL接種于與BacT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀配套的BacT/ALERT血培養(yǎng)瓶進(jìn)行血培養(yǎng)。

1.2.2 涂片鏡檢 取患者組織或骨髓直接涂片,標(biāo)本血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后菌液涂片,鏡檢并分別進(jìn)行瑞氏染色及革蘭染色，顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征。

1.2.3 真菌學(xué)檢查 血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后，分別接種2個(gè)沙保羅瓊脂平板，分別置于28℃和35℃培養(yǎng),觀察各培養(yǎng)物在不同溫度下的菌落形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.4 PM鑒定標(biāo)準(zhǔn) (1)溫度依賴(lài)性雙相菌，28℃培養(yǎng)呈菌絲相，35℃培養(yǎng)呈酵母相。(2)在沙保羅培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)第2天可見(jiàn)較小菌落，并在培養(yǎng)基中可見(jiàn)水溶性紅色色素，第3天菌落較大并出現(xiàn)白色絨毛狀，培養(yǎng)基中可見(jiàn)明顯的水溶性玫瑰紅色，第5天整個(gè)平皿均呈玫瑰紅色，菌落較大呈黃褐色、白色絨毛狀；35℃培養(yǎng)于第3天出現(xiàn)酵母樣菌落，無(wú)色素及絨毛狀，5 d后較成熟菌落有腦回樣皺褶。(3)28℃涂片革蘭染色呈典型的帚狀枝；35℃涂片革蘭染色呈長(zhǎng)形酵母樣孢子，孢子中間可見(jiàn)分隔為臘腸型細(xì)胞，可見(jiàn)少量的菌絲。PM的孢子與組織胞漿菌孢子容易混淆，但PM常有橫隔，不出芽。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

1.2.5.1 菌液制備 用無(wú)菌棉拭子蘸取35℃培養(yǎng)的PM菌落置于加有1mL生理鹽水的無(wú)菌試管中，在麥?zhǔn)媳葷醿x上，以0.5麥?zhǔn)蠁挝粸闃?biāo)準(zhǔn)，調(diào)整菌液濁度。

1.2.5.2 E-test法 無(wú)菌操作下，用無(wú)菌棉拭子將制備好的菌懸液均勻涂布至真菌藥敏培養(yǎng)基上，待平板表面干后，用無(wú)菌鑷子將上述4種E-test抗真菌試紙條分別置于培養(yǎng)基平板上，置于35℃溫箱培養(yǎng)。

1.2.5.3 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)判定 按CLSI推薦的方法，于接種后每24 h觀察1次，其中伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑48 h讀取結(jié)果，兩性霉素B 24 h或48 h讀取結(jié)果均可。

1.2.5.4 藥敏折點(diǎn)[3-5]伊曲康唑(S:MIC≤0.125 μg/mL；R：MIC≥1 μg/mL)；伏立康唑(S:MIC≤1 μg/mL)；兩性霉素B(S:MIC≤1 μg/mL；R：MIC≥4 μg/mL)；氟康唑(S:MIC≤8 μg/mL；R：MIC≥64 μg/mL)。

1.2.6 試驗(yàn)質(zhì)控 近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis,Cp)ATCC 22019為質(zhì)控菌株[6]，購(gòu)于Mecconti公司(盧森堡)。質(zhì)控結(jié)果伊曲康唑?yàn)?.12 μg/mL(允許范圍0.064～0.25 μg/mL)；伏立康唑?yàn)?.064 μg/mL(允許范圍0.06～0.25 μg/mL)；兩性霉素B為0.5 μg/mL (允許范圍0.25～1.00 μg/mL)；氟康唑?yàn)? μg/mL(允許范圍2.0～8.0 μg/mL)。

2 結(jié)果

2.1 組織及外周血(骨髓)中PM形態(tài) 組織標(biāo)本瑞氏染色直接鏡檢，可見(jiàn)典型卵圓形或圓形有明顯橫隔的孢子，常位于巨噬細(xì)胞內(nèi)。血培養(yǎng)標(biāo)本革蘭染色鏡檢，可見(jiàn)菌體兩端鈍圓略彎曲呈臘腸樣，偶有分枝狀，可見(jiàn)有橫隔。見(jiàn)圖1～2。

圖1 組織直接鏡檢PM形態(tài) (瑞氏染色，100×)

Figure 1 Direct microscopic observation for morphology of PM from tissue (Wright’s staining, 100×)

圖2 血培養(yǎng)鏡檢PM形態(tài)(革蘭染色，100×)

Figure 2 Microscopic observation of morphology of PM from blood culture(Gram staining，100×)

2.2 真菌培養(yǎng)特征

2.2.1 菌落特征 28℃培養(yǎng)呈菌絲相，沙保羅培養(yǎng)基上2～3 d產(chǎn)生菌落，呈淡灰褐色膜樣或淡黃色絨狀，直徑約5 mm，并產(chǎn)生紅色色素，擴(kuò)散入培養(yǎng)基中；5～7 d變?yōu)闇\黃色絨狀，可見(jiàn)菌落表面干燥粗糙，中央?yún)^(qū)隆起，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，色素進(jìn)一步加深，可彌散到整個(gè)培養(yǎng)基。見(jiàn)圖3。35℃沙保羅培養(yǎng)基上呈酵母相生長(zhǎng)，生長(zhǎng)較28℃緩慢，3～4 d可見(jiàn)圓形、灰白色、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的酵母樣菌落，無(wú)色素生成；6～8 d菌落直徑約3～5 mm，呈淡灰褐色或奶酪色模樣，繼續(xù)培養(yǎng)后菌落明顯增大，邊緣可出現(xiàn)褶皺，中心較濕潤(rùn)，表面光滑。有些菌落可從酵母樣向菌絲相轉(zhuǎn)變，可出現(xiàn)灰白色絨毛狀菌落及產(chǎn)生紅色色素。見(jiàn)圖4。

圖3 28°C培養(yǎng)PM菌落特征

圖4 35°C培養(yǎng)PM菌落特征

2.2.2 顯微鏡下菌體特征 挑取28℃培養(yǎng)菌落，涂片置于高倍鏡下觀察，鏡下可見(jiàn)有分枝、分隔無(wú)色透明的菌絲, 可見(jiàn)帚狀枝，雙輪或單輪生，梗基上有3～6個(gè)瓶梗，分生孢子卵圓形或圓形，直徑2～3 μm，有明顯的孢子間連體。見(jiàn)圖5。35℃培養(yǎng)菌落顯微鏡下可見(jiàn)圓形或卵圓形、大小輕度不一,直徑約3 μm的酵母樣菌體，混有少許短菌絲，菌體表面光滑，無(wú)色透明。有些菌體處在增殖活躍期，可見(jiàn)菌體變長(zhǎng)，兩端鈍圓略彎曲呈臘腸樣，少數(shù)可見(jiàn)有橫隔。見(jiàn)圖6。

圖5 28°C PM培養(yǎng)物鏡下特點(diǎn)(棉蘭染色，100×)

Figure 5 Microscopic characteristics of PM cultured at 28°C(Medan staining，100×)

圖6 35°C PM培養(yǎng)物鏡下特點(diǎn) (棉蘭染色，100×)

Figure 6 Microscopic characteristics of PM cultured at 35°C(Medan staining，100×)

2.3 藥敏結(jié)果 參照酵母相真菌的藥敏折點(diǎn)，對(duì)伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B均敏感，敏感率達(dá)100%，對(duì)氟康唑有5株為中介，敏感率為78.26%。4種抗真菌藥物中，以伊曲康唑MIC最低，其次是伏立康唑、兩性霉素B，而氟康唑敏感性相對(duì)較弱。4種藥物對(duì)各菌株的MIC見(jiàn)表1。

3 討論

對(duì)于發(fā)熱時(shí)間較長(zhǎng)且原因不明，肝脾淋巴結(jié)大，有壞死性丘疹的患者，尤其有廣東、廣西、湖南等地居住史的患者，應(yīng)警惕PSM。由于PM侵犯部位廣泛，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，無(wú)特異性，常伴發(fā)于其他疾病，因此可能被更嚴(yán)重疾病的癥狀所掩蓋，其中病變局限于肺者，臨床表現(xiàn)似肺結(jié)核，極易誤診，本研究即有病例為此類(lèi)情況。23例患者中，16例確診為艾滋病未報(bào)告PM就已出院；1例結(jié)核感染并免疫缺陷患兒在使用兩性霉素B后發(fā)熱癥狀有所控制，但最終因嚴(yán)重膿毒血癥而搶救無(wú)效死亡；1例免疫缺陷患兒在培養(yǎng)出PM時(shí)使用氟康唑后體溫較前降低，因重度免疫缺陷治療2 d后要求出院；3例懷疑為真菌感染的患者最初使用伏立康唑治療時(shí)感染控制，待最終確診為艾滋病并培養(yǎng)出PM時(shí)已轉(zhuǎn)院；1例培養(yǎng)出PM后使用兩性霉素B的患者治療效果佳，但出現(xiàn)消化道不良反應(yīng)，確診艾滋病后即轉(zhuǎn)院治療；1例懷疑為HIV并真菌感染的患者使用氟康唑時(shí)感染控制，但未報(bào)告培養(yǎng)出PM就已轉(zhuǎn)院。使用了伏立康唑、兩性霉素B及氟康唑的患者感染發(fā)熱癥狀得到控制，最終治療有效，但最終因原發(fā)病轉(zhuǎn)院或者死亡。

表1 4種藥物對(duì)23株酵母相(35℃)PM的MIC(μg/mL)

Table 1 MICs of four kinds of antifungal agents to 23 isolates of PM in yeast phase(35°C) (μg/mL)

菌株編號(hào)伊曲康唑伏立康唑兩性霉素B氟康唑10.0080.0230.5002.00020.0080.0120.0161.00030.0020.0230.04816.00040.0160.1250.0328.00050.0030.0120.0648.00060.0040.0230.0024.00070.0020.0230.0508.00080.0040.1250.0323.00090.0020.0230.0321.500100.0020.0120.0161.000110.0060.0160.06416.000120.0160.0230.0648.000130.0040.1250.0020.500140.0160.0230.5008.000150.0060.0160.06416.000160.0040.0230.0324.000170.0040.0160.0504.000180.0080.0160.0328.000190.0060.0160.06416.000200.0040.1250.0323.000210.0020.0230.0508.000220.0020.0120.0161.000230.0060.0160.06416.000

PSM診斷較困難，需經(jīng)標(biāo)本直接涂片染色(除本文中用到的革蘭和瑞氏染色外還可以結(jié)合HE、PAS和PASM染色)以及分離培養(yǎng)出PM方能確診[7]。PM為深部條件致病菌，因菌株間的個(gè)體差異以及耐藥性等因素，其對(duì)各種抗真菌藥物的敏感性不一致，因而進(jìn)行體外抗真菌藥敏試驗(yàn)是必需的。由于人體溫度一般為37℃左右，對(duì)35℃酵母相PM進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)更有利于為臨床感染PM患者的用藥提供參考。若有可能，可以對(duì)PM 25℃菌絲相進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，并比較兩種不同溫度相之間是否存在差異。本研究根據(jù)CLSI制定的M27-A3方案，采用E-test法對(duì)35℃酵母相PM進(jìn)行藥敏測(cè)試。目前認(rèn)為，E-test法可以作為標(biāo)準(zhǔn)化液基稀釋法的一種替代方法[8-9]，國(guó)外有文獻(xiàn)[3]報(bào)道該法與微量稀釋法具有良好的一致性。《桑福德抗微生物治療指南》(第44版)指出，PSM抗菌藥物治療首選兩性霉素B，后續(xù)伊曲康唑口服治療，HIV感染者需長(zhǎng)期使用。目前，臨床多采用兩性霉素B控制癥狀后改用伊曲康唑繼續(xù)治療的聯(lián)合用藥方法[10-12]。M27-A2[13]和M38-A[14]中受試的抗真菌藥物在原有兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、氟康唑基礎(chǔ)上增加了伏立康唑、泊沙康唑、雷夫康唑。本研究選用伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、氟康唑4種臨床較常用的抗酵母樣真菌藥物，發(fā)現(xiàn)在酵母相PM抗真菌藥敏檢測(cè)中，以伊曲康唑敏感性最強(qiáng)，其次是伏立康唑、兩性霉素B，而氟康唑敏感性相對(duì)較弱，結(jié)論與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[15-18]報(bào)道基本一致，其中本研究伊曲康唑敏感性稍高于伏立康唑，與韋高等[15]報(bào)道不一致，可能系地區(qū)差異所致。臨床上發(fā)現(xiàn)對(duì)于酵母樣真菌，兩性霉素B的敏感性高于伊曲康唑及伏立康唑，與我們所做體外藥敏試驗(yàn)有所不同，可能與兩性霉素B副作用較大，臨床使用較伊曲康唑及伏立康唑少有關(guān)。

目前，實(shí)施雙相性真菌的標(biāo)準(zhǔn)化藥敏試驗(yàn)較困難，各實(shí)驗(yàn)室均在積極探索能被廣泛接受的方法。本研究采用E-test法測(cè)試雙相性真菌藥物敏感性試驗(yàn)，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，結(jié)果易于判讀，可以作為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗真菌藥物敏感試驗(yàn)?zāi)転榕R床合理使用抗真菌藥物提供參考依據(jù)，所以我們應(yīng)不斷尋求更有效、更科學(xué)的方法。

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(本文編輯：左雙燕)

Identification and in vitro antifungal susceptibility of Penicillium marneffei in yeast phase

XIELiang-yi，WANGJuan，ZHANGJing，CHENGZhen-bo，LIHao，LIANGJian，ZHENGShu-juan，ZENGLing，DENGZhong-hua

(HunanProvincialPeople’sHospital,Changsha410005,China)

Objective To understand the identification and in vitro antifungal susceptibility ofPenicilliummarneffei(PM) in yeast phase, and guide clinic antifungal application.Methods Strains isolated from blood and bone marrow of 23 patients infected with PM in a hospital between 2009 and 2016 were collected, colony morphology of PM in yeast phase was observed, susceptibility to itraconazole, voriconazole, amphotericin B, and fluconazole were detected with E-test method.Results Colony morphology of PM were as follows: direct microscopic examination of Wright’s staining of tissue specimens found visible oval or round spore with apparent septum, and mainly located in macrophage; Gram staining of blood culture specimens found that strains were with bulbous and slightly curved ends, occasionally branched and with septum. PM was dimorphic fungi, presented mycelium at 28°C, produced red pigment and diffused into medium; PM presented yeast form at 35°C, there were typical colony morphology. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of itraconazole, voriconazole, amphotericin B, and fluconazole to PM in yeast phase were 0.002-0.016, 0.012-0.125, 0.002-0.500, and 0.500-16.000 μg/mL respectively.Conclusion Typical colony morphology and fungal spore of PM in bone marrow and peripheral blood are important features for identification. PM is most susceptible to itraconazole, followed by voriconazole and amphotericin B, while fluconazole is less susceptible.

Penicilliosis marneffei;Penicilliummarneffei； dimorphic fungus； drug resistance, microbial; fungus

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.009

2016-09-15

湖南省人民醫(yī)院仁術(shù)基金資助項(xiàng)目(2011年)

謝良伊(1978-)，女(漢族)，湖南省婁底市人，副主任技師，主要從事臨床病原菌實(shí)驗(yàn)室診斷、耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)研究。

謝良伊 E-mail：47830778@qq.com

R379.9 R512.91

A

1671-9638(2016)12-0934-05