食源性產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌的分布及其同源性研究

賓羽琳，王 萌，陳 艷，邱燦林，招 莉，鐘啟麗

(1 韶關學院醫(yī)學院,廣東 韶關 512026； 2 韶關市疾病預防控制中心,廣東 韶關 512026)

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食源性產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌的分布及其同源性研究

賓羽琳1，王 萌1，陳 艷1，邱燦林2，招 莉2，鐘啟麗2

(1 韶關學院醫(yī)學院,廣東 韶關 512026； 2 韶關市疾病預防控制中心,廣東 韶關 512026)

目的 了解不同食源性傳播介質中產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌的分布情況及同源性。方法從2014—2015年韶關市不同來源的食源性樣本中分離產ESBLs大腸埃希菌，采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術和BioNumerics軟件對菌株進行分型。結果347份不同來源的食源性樣本中檢出11株致腹瀉大腸埃希菌和29株產ESBLs大腸埃希菌。PFGE圖譜分析，29株菌可以分為21個聚類群，其中聚類A包含7株菌(J2、J3、J4、J7、J9、B4、S3)，為優(yōu)勢的PFGE帶型，聚類B有2株菌(J6、J8)，其余菌株帶型為分散克隆。3株健康從業(yè)人員分離菌(J2、J7、J9)相似系數為100%，生活飲用水分離菌(S3)與腹瀉患者分離菌(B4)的相似系數為97.1%，S3菌與4株健康從業(yè)人員分離菌(J2、J3、J7、J9)相似系數均>90.0%。結論韶關市食源性產ESBLs大腸埃希菌在食品、水、動物和人群中廣泛分布，并可能通過食物鏈相互傳播，應加強監(jiān)測，防止進一步擴散。

食源性； 超廣譜β-內酰胺酶； ESBLs； 大腸埃希菌； 脈沖場凝膠電泳； PFGE； 聚集性

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：907-912]

食源性疾病是全球高度關注的、日益嚴重的公共衛(wèi)生問題之一，而病原微生物是主要的病因[1]。隨著食品加工、銷售的產業(yè)化與全球化，食源性疾病已突破傳統(tǒng)的點源暴發(fā)，呈現多地同源暴發(fā)或散發(fā)趨勢。2004年我國建立食源性致病菌的監(jiān)測網和病原菌分子分型監(jiān)測網絡，對主要食源性致病菌開展主動監(jiān)測及溯源，應對日益嚴峻的食源性疾病，但該監(jiān)測體系還不完善，納入監(jiān)測的致病菌比較局限，趙懷龍等[2]認為應擴大食源性病原菌檢測的種類，提高實驗室檢測能力，健全我國食源性疾病監(jiān)測網絡和報告體系，使監(jiān)測數據真實反映我國食源性疾病的現狀。大腸埃希菌(Escherichiacoli)是人和動物腸道中的正常菌群，是重要的腸道指示菌和條件致病菌，其中產超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)大腸埃希菌越來越受到關注。本文以食源性產ESBLs 大腸埃希菌為切入點，研究其在不同食源性傳播介質中的分布，并應用脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)技術對分離株進行分子分型及同源性分析，初步建立韶關市食源性產ESBLs 大腸埃希菌的PFGE分子分型數據庫，有利于韶關市開展食源性傳染病的溯源及其聚集性識別。

1 材料與方法

1.1 標本來源 食品：韶關市疾病預防控制中心依據2014年和2015年《韶關市食品安全風險因素評價專項監(jiān)測工作方案》，采集生肉類、熟食類、水(海)產類、蔬菜類等標本共100份。生活飲用水：2014—2015年自來水廠入廠水、井水、山泉水、水庫水等生活飲用水源水共60份，其中45份標本由韶關市疾病預防控制中心采集送檢。食源性動物：采集2014—2015年韶關市區(qū)家禽家畜批發(fā)市場和近郊3個養(yǎng)殖場的雞、鴨、豬等糞便或肛拭子共57份標本。健康從業(yè)人群：采集2015年韶關市食品和公共場所從業(yè)人員常規(guī)體檢肛拭子標本50份，由市區(qū)某醫(yī)院體檢科采樣送檢。腹瀉患者：2014—2015年臨床腸道感染性疾病患者糞便或肛拭子80份，由韶關市各醫(yī)院、市疾病預防控制中心提供。對照標本：12株來自珠海某醫(yī)院臨床腹瀉患者的產ESBLs 大腸埃希菌。

1.2 主要試劑與儀器 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、乳糖蛋白胨水均購自杭州天和微生物試劑有限公司，大腸埃希菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，ESBLs確證試驗抗生素紙片為英國OXOID 公司產品，限制性內切酶XbaⅠ為美國Promega公司產品，蛋白酶為美國MERCK公司產品。自動細菌鑒定及藥敏測定系統(tǒng)購自法國生物梅里埃公司，脈沖場凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 大腸埃希菌的分離鑒定 依據《感染性腹瀉的診斷標準及處理原則》、《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》、《生活飲用水衛(wèi)生標準檢驗方法》及《廣東省疾控系統(tǒng)2013年食源性致病菌監(jiān)測檢驗方法》對各類標本進行分離、培養(yǎng)和鑒定。

1.3.2 產ESBLs大腸埃希菌的檢測 經自動細菌鑒定及藥敏分析儀初篩產ESBLs的菌株，參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦的方法進行產ESBLs菌株的確證試驗：采用頭孢他啶(30 μg)及頭孢他啶/克拉維酸(30 μg/10 μg)組合，頭孢噻肟(30 μg)及頭孢噻肟/克拉維酸(30 μg/10 μg)組合，當任何一種復合物紙片抑菌圈直徑大于或等于其單獨藥敏紙片抑菌圈直徑5 mm，可確證產ESBLs。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3.3 PFGE 將檢出的產ESBLs 大腸埃希菌及珠海市提供的對照菌株送至廣東省疾病預防控制中心進行PFGE分子分型，操作參照美國疾病控制與預防中心PulseNet試驗方法，采用Bionumerics軟件對圖譜進行分析。采用Tenover等[3]提出的判定標準：當菌株PFGE條帶型別完全相同時，可判定為相同型別；當條帶型別相差2～3個條帶時，判定為密切相關；當條帶型別相差4～6個條帶時，判定為可能相似；當條帶型別相差7個條帶及以上時，則可判定為不同菌株。系統(tǒng)根據指紋圖譜將每個條帶轉換為二進制數據，按公式計算出相似性系數(Ssm=2×W/(a+b)，W:兩菌株共有條帶數；a:A菌條帶數；b：B菌條帶數)，相似性系數越大菌株間親緣關系越近，公式換算后可將相似系數>90%的菌株判定為密切相關。

2 結果

2.1 培養(yǎng)鑒定結果 各類標本共檢出大腸埃希菌147株，經血清分型鑒定出致腹瀉大腸埃希菌11株，其中生活飲用水中檢出4株，分別為2株腸毒素型大腸埃希菌(ETEC)O78K80和2株ETEC O25K19；腹瀉患者中檢出6株，分別為腸致病性大腸埃希菌(EPEC)O142K86和EPEC O125K70、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)O136K78和EIEC O124K72、ETEC O8K40(A)K47(A)和ETEC O25K19(L)；食源性動物(鴨)中檢出1株EPEC O86K61K62，其余均為非致腹瀉大腸埃希菌。經ESBLs確證試驗147株大腸埃希菌，產ESBLs菌株29株，腹瀉患者標本中檢出的1株EPEC和1株ETEC同時產ESBLs。見表1～2。

表1 不同來源標本檢出大腸埃希菌情況

*：其中1株為雞場工作人員傷口分泌物檢出菌

表2 29株產ESBLs大腸埃希菌的標本信息

2.2 產ESBLs 大腸埃希菌PFGE分型 對PFGE圖譜進行聚類分析，29株菌可以分為21個聚類群，其中聚類A包含7株菌(J2、J3、J4、J7、J9、B4、S3)，為優(yōu)勢的PFGE帶型，聚類B有2株菌(J6、J8)，其余菌株帶型為分散克隆。見圖1～2。3株健康從業(yè)人員分離菌(J2、J7、J9)間的相似系數為100%，生活飲用水分離菌(S3)與腹瀉患者分離菌(B4)的相似系數高達97.1%，生活飲用水分離菌(S3)與4株健康從業(yè)人員分離菌(J2、J3、J7、J9)、腹瀉患者分離菌(B4)與健康從業(yè)人員分離菌(J2、J7、J9)相似系數均>90.0%。韶關市與珠海市腹瀉患者標本共分離產ESBLs 大腸埃希菌株21株，分為19種不同的PFGE帶型，珠海市患者標本兩組分離菌(ZH1與ZH10，ZH7與ZH8)的帶型相同，其余菌株的相似系數均<90%。見圖3。

M：參考菌株H9812；J1～J9：健康從業(yè)人員檢出菌株；B1～B9：腹瀉患者檢出菌株；D1～D8：食用動物檢出菌株；S1～S3：水源水檢出菌株

圖2 韶關市食源性產ESBLs大腸埃希菌PFGE圖譜的聚類分析圖

Figure 2 PFGE cluster analysis of foodborne-associated ESBLs-producingE.coliin Shaoguan

注：B1～B9為韶關市腹瀉患者檢出菌株；ZH-1～ZH-12為珠海市腹瀉患者檢出菌株

3 討論

大腸埃希菌是國際公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌，主要經食物傳播，近年該菌引起的食源性疾病在世界范圍內呈上升趨勢[4]。韶關市多年監(jiān)測數據[5]表明，致腹瀉大腸埃希菌是引發(fā)當地腸道傳染病暴發(fā)的主要病原菌，占病原體的59.79%。食品、生活飲用水、食源性動物、食品加工與公共場所從業(yè)人員是食源性疾病的主要傳播介質。本研究監(jiān)測了上述傳播介質中大腸埃希菌的攜帶情況，共檢出147株大腸埃希菌，從生活飲用水、食源性動物和腹瀉患者標本中檢出11株致腹瀉大腸埃希菌，血清型比較分散，無聚集。此外，從生活飲用水、食源性動物、健康從業(yè)人員和腹瀉患者標本中檢出產ESBLs大腸埃希菌29株，其中腹瀉患者分離的2株致腹瀉大腸埃希菌同時產ESBLs，本研究顯示韶關市食源性疾病傳播介質中，致腹瀉大腸埃希菌和產ESBLs 大腸埃希菌呈一定比例分布。大腸埃希菌是耐藥基因的重要儲存庫, 在耐藥基因的傳播中發(fā)揮重要作用，食源性產ESBLs 大腸埃希菌可通過食物鏈進入人體，一旦在腸道中定植，其耐藥基因可在不同菌株之間傳播，臨床治療非常困難，造成的危害不亞于由致病菌引起的暴發(fā)性疾病。

PFGE具有對腸道致病菌的分型能力強，易于分析和標準化等優(yōu)點，被譽為細菌分子分型技術的“金標準”[6]。通過對PFGE圖譜進行分析，能識別不同來源菌株間的親緣關系。目前已被廣泛應用于食源性疾病溯源、傳染病的流行監(jiān)測、病原菌耐藥性研究等方面[7-8]。本研究應用PFGE技術對29株食源性產ESBLs大腸埃希菌進行分子分型，按照90%的相似度分為21個聚類群，大部分菌株呈散發(fā)克隆分布,目前未出現大規(guī)模的流行克隆。值得關注的是，聚類A群中包含了7株分離菌，多于其他聚類群，為韶關市食源性產ESBLs大腸埃希菌的主要流行型別，其中5株菌分離于食品加工或公共場所健康從業(yè)人員，編號J2、J7、J9三株分離菌帶型相同，提示在本市健康從業(yè)人員間存在著相同克隆，一旦帶菌者嚴重聚集或通過食品加工環(huán)節(jié)傳播該菌，可能會引起疾病的暴發(fā)。山泉水分離菌(S3)與腹瀉患者分離菌(B4)、4株健康從業(yè)人員分離菌(J2、J3、J7、J9) 的相似性系數均>90.0%。山泉水于2015年5月采自本市市中心某山上，該采水點為市民私自開發(fā)引流，無任何消毒處理設施，在同年6月獲得患者分離菌，同年7月獲得健康從業(yè)人員分離菌，上述標本的采樣時間雖不同，但患者和健康從業(yè)人員的居住和工作地點與水源為同一片區(qū)，菌株間表現出高度的相似性，懷疑這幾株菌的分離人群可能飲用受污染的水源或食用被水源污染的食物，提示產ESBLs大腸埃希菌可能在環(huán)境、水、食品和人中相互傳播。因此，通過對環(huán)境、水、食品和從業(yè)人員的主動監(jiān)測，有利于查找感染性事件發(fā)生的傳染源和傳播途徑，指導采取正確的防治措施。

本研究未發(fā)現產ESBLs 大腸埃希菌在不同種群間(即雞與豬、雞與鴨、雞與人、豬與人)存在克隆性的傳播，與佟盼盼[9]的研究結果一致，但帶菌動物的糞便有可能通過污染水源、食物或食品加工環(huán)節(jié)而感染人體，對人體健康存在潛在的威脅，應加強主動監(jiān)測。另外，韶關市與珠海市兩地的孤立病例呈散發(fā)分布，與臨床研究[10-11]結果一致，認為外源性感染或社區(qū)感染是孤立病例產ESBLs大腸埃希菌感染的主要途徑，張帥[12]推測，食品也可能是腸外致腹瀉大腸埃希菌致病的傳播媒介。

由于食源性標本的種類多，來源范圍廣，本研究在標本類型和數量的設計上存在一定的局限性，另外，本研究的病例是分散型病例，缺乏完整的流行病學資料，僅以PFGE溯源識別菌株的親緣關系，無法確認病例的感染是否經食物鏈導致，需在日后進一步的研究中加以改善。

韶關市食源性產ESBLs大腸埃希菌在食品、水、動物和人群中廣泛分布，PFGE分型結果提示韶關市食源性產ESBLs大腸埃希菌可能通過食物鏈相互傳播，應加強監(jiān)測，防止進一步擴散。PFGE可分析病例、可疑食品及污染環(huán)節(jié)中病原菌間的遺傳相關性，起到明確診斷及早期預警作用，建議韶關市疾病防控部門盡早將PFGE技術應用于食源性致病菌的分析研究，建立以PFGE技術為核心的食源性疾病監(jiān)測溯源網絡,為本市的食源性疾病和傳染病的防控提供技術保障。

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(本文編輯：豆清婭)

Distribution and homology of foodborne-associated extended-spectrum β-lactamases-producing Escherichia coli

BINYu-lin1,WANGMeng1,CHENYan1，QIUCan-lin2，ZHAOLi2，ZHONGQi-li2

(1MedicalCollegeofShaoguanUniversity,Shaoguan512026,China; 2ShaoguanCenterforDiseaseControlandPrevention,Shaoguan512026,China)

Objective To study the distribution and homology of foodborne-associated extended-spectrum β-lactamases (ESBLs)-producingEscherichiacoli(E.coli).Methods ESBLs-producingE.coliwere isolated from different food specimens in Shaoguan from 2014 to 2015, strains were typed with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and BioNumerics software.Results 11 strains of diarrhea-causingE.coliand 29 strains of ESBLs-producingE.coliwere isolated from 347 different sources of food specimens. PFGE analysis showed that 29 strains could be divided into 21 cluster groups, group A was predominant pattern, which included 7 strains(J2, J3, J4, J7, J9, B4, S3), group B included 2 strains (J6, J8), the other strains were sporadic clones. Similarity coefficient (SC) of 3 strains (J2, J7, J9) from health practitioners was 100%，SC of strains from drinking water and patients with diarrhea (B4) was 97.1%，SC of S3 strain and 4 strains (J2, J3, J7, J9) from health practitioners were all>90.0%.Conclusion Foodborne-associated ESBLs-producingE.coliare widely distributed in food, water, animal, and populations, and can be transmitted through food chain, surveillance should enhanced to avoid further spread.

foodborne; extended-spectrum β-lactamase; ESBLs;Escherichiacoli; pulsed-field gel electrophoresis; PFGE; clustering

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.003

2016-03-01

韶關市科技局科技研究資金(2014CX-K280)

賓羽琳(1975-)，女(漢族)，廣東省韶關市人，副主任技師，主要從事微生物學檢驗研究。

賓羽琳 E-mail:1368655059@qq.com

R183.4 R378.2+1

A

1671-9638(2016)12-0907-06