社區獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型及藥敏結果

牛瑞兵，郭利平，王新剛，段寶生，巴特爾

(鄂爾多斯市中心醫院，內蒙古 鄂爾多斯 017000)

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·論著·

社區獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型及藥敏結果

牛瑞兵，郭利平，王新剛，段寶生，巴特爾

(鄂爾多斯市中心醫院，內蒙古 鄂爾多斯 017000)

目的 了解某院門診和住院患者標本分離的社區獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)盒式染色體基因(SCCmec)型別以及CA-MRSA耐藥性。方法收集該院2011年5月—2015年8月分離的MRSA及其相關病史資料，利用聚合酶鏈反應(PCR)方法進行MRSA的mecA基因和CA-MRSA的SCCmec基因分型檢測，對CA-MRSA進行藥物敏感性試驗并進行統計分析。結果共收集MRSA 305株，其中mecA陽性296株。CA-MRSA 88株，占29.73%(88/296)，其中48株為SCCmecⅣ型，36株為SCCmecⅤ型，4株未定型。藥敏試驗顯示，CA-MRSA對萬古霉素、利奈唑胺、替加環素均100%敏感，對青霉素和苯唑西林100%耐藥；SCCmecⅣ和Ⅴ型CA-MRSA對左氧氟沙星、利福平、環丙沙星的耐藥率比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。SCCmecⅣ、Ⅴ型CA-MRSA對氨芐西林/舒巴坦、呋喃妥因、紅霉素的耐藥率均>58%。結論該院CA-MRSA的SCCmec分型以Ⅳ和Ⅴ型為主，且耐藥率較高，臨床醫生應對此高度重視,根據藥敏結果合理應用抗菌藥物。

金黃色葡萄球菌； 社區獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； CA-MRSA； SCCmec基因分型； 抗藥性，微生物； 耐藥性； 合理用藥

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：897-901]

1961年發現的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)現在是社區獲得性感染的重要病原菌，并且感染率有逐年上升的趨勢[1]。與醫院獲得性MRSA(hospital-acquired MRSA，HA-MRSA)感染不同,社區獲得性MRSA(community-acquired MRSA，CA-MRSA)感染通常發生在社區環境中，是導致皮膚及軟組織獲得感染的主要因素[2]。MRSA的耐藥機制主要是獲得了外源性葡萄球菌盒式染色體基因(staphylococcal cassette chromosomemec, SCCmec)，其攜帶mecA基因在內的多種耐藥基因，SCCmec的結構具有高度多態性，可分為不同的型[3]。本研究利用多重聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測MRSA的mecA基因和CA-MRSA的SCCmec基因型，研究鄂爾多斯地區CA-MRSA的基因型及藥物敏感情況，為預測發展趨勢，控制暴發流行，治療CA-MRSA感染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集鄂爾多斯市中心醫院2011年5月—2015年8月門診和住院患者微生物標本分離鑒定的MRSA 305株，所有菌株均為非重復菌株，同一患者同一部位只取1次分離株。MRSA的篩查用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀，所用質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923購于衛生部臨床檢驗中心。用PCR方法檢測mecA基因確定MRSA 296株。

1.1.2 CA-MRSA的診斷 符合以下條件的為CA-MRSA感染[3]：患者在門診就診時MRSA培養陽性或在入院48 h內MRSA培養陽性；患者無MRSA感染或定植的病史；患者在過去一年中無住院史，無外科手術史，無護理中心入住史，無透析史，患者無永久留置的管腔或經皮膚進入體內的醫療裝置。

1.1.3 主要試劑及儀器 細菌基因組提取試劑盒、溶葡球菌酶、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、100 bp DNA Ladder、瓊脂糖、核酸染料均購于南京博爾迪生物科技有限公司。實驗所有引物序列由上海生工生物工程技術有限公司合成。BioRad公司PCR擴增儀(PTC-200)，北京六一儀器廠DYY-6C型電泳儀，英國Syngene公司電泳成像分析系統。法國VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀及藥敏系統，藥敏卡及培養基全部購于北京威泰科生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MRSA基因組DNA模板提取 將已凍存的菌株重新接種于哥倫比亞血平板上，置37℃溫箱中孵育18～24 h。用滅菌環從血平板上挑取8～10個復活菌落置于300 μL含溶葡球菌酶液中，置37℃溫箱中水浴30 min，取出放入100℃沸水中小火煮10 min，12 000 r/mim離心5 min，其余方法按照細菌DNA提取試劑盒的操作進行，提取DNA置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2mecA基因檢測 參照文獻[4]合成mecA基因擴增引物:MECAP4：5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’，MECAP7：5’-CCACTTCATATCTTGTAAGG-3’，擴增片段大小約為162 bp。采用PCR方法對初篩的MRSA進行分子學檢測，攜帶mecA基因的確定為MRSA菌株。PCR擴增體系為25 μL，其中DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，MECAP40.25 μL，MECAP70.25 μL，余ddH2O補足。PCR擴增條件為94℃初變性4 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃延伸4 min，1.5%瓊脂糖電泳，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察目的條帶，并拍照成像。

1.2.3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型 參照2007年Milheirico等[5]方法設計10對引物，采用多重PCR的方法對CA-MRSA菌株進行SCCmec基因分型，所用引物見表1。反應體系為25 μL，其中DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，各種引物的最終濃度和用量參考文獻，余ddH2O補足。PCR擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃延伸7 min。取10 μL PCR產物點樣，在 1.8%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，結果拍照保存。

1.2.4 藥物敏感試驗 采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏系統對分離的CA-MRSA進行16種抗菌藥物的敏感性試驗。結果判定采用美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2005年版標準進行。

1.3 統計學分析 所收集數據應用WHONET 5.2軟件和SPSS 15.0統計軟件進行分析，CA-MRSA SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型耐藥率比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

表1 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型所用引物

2 結果

2.1 CA-MRSA標本來源 根據臨床診斷共獲得88株CA-MRSA，來自于皮膚科、骨科、普通外科、兒科、腫瘤科、重癥監護病房(ICU)、神經外科等12個科室，其中以兒科、皮膚科和骨科所占比率最高。見圖1。

圖1 88株CA-MRSA來源科室分布

2.2 MRSA菌株多重PCR鑒定結果 經多重PCR擴增，擴增產物凝膠電泳圖成像顯示，305株MRSA 中mecA基因陽性296株。見圖2。

2.3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型結果 利用多重PCR方法對88株CA-MRSA進行SCCmec基因分型，48株為SCCmecⅣ型，36株為SCCmecⅤ型，4株未定型。見圖3。

M: DNA ladder maker(100～1 500 bp)；1—11泳道：臨床MASA菌株；-:陰性對照

圖2mecA基因PCR擴增產物電泳圖

Figure 2 Electrophoresis map of PCR amplification products ofmecA gene

M: DNA ladder maker(100～1 500 bP)；1—15：CA-MRSA菌株；-:陰性對照；其中1、2泳道菌株SCCmec分型未定型，3、4、9、10號菌株為SCCmecⅤ型，5—8、11—15號菌株為SCCmecⅣ型

圖3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型電泳圖

Figure 3 Electrophoresis map of CA-MRSA SCCmecgenotyping

2.4 CA-MRSA藥敏結果 84株SCCmec分型的CA-MRSA對萬古霉素、利奈唑胺、替加環素均100%敏感，對青霉素和苯唑西林100%耐藥；SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA對左氧氟沙星、環丙沙星、利福平的耐藥率比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，對其余9種抗菌藥物的耐藥率均相對較高。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為66.67%、69.44%，對呋喃妥因的耐藥率分別為62.50%、58.33%，對紅霉素的耐藥率分別為66.67%，69.44%。見表2。

表2 不同SCCmec基因型CA-MRSA對抗菌藥物的耐藥情況[株(%)]

3 討論

MRSA既是醫院獲得性感染，也是社區獲得性感染的主要病原菌之一。雖然醫療技術在高速發展，但MRSA感染率及病死率一直居高不下。根據文獻[6]報道，從20世紀90年代開始CA-MRSA感染在國內外的不同地區均十分嚴峻，甚至發生暴發流行。SCCmec基因分型是研究CA-MRSA菌株基因型變化或流行病學的最常用方法，也是區分HA-MRSA和CA-MRSA感染的一種重要檢測方法[7]。

本研究顯示，鄂爾多斯市中心醫院門診與病房標本分離的296株MRSA中，根據病史資料CA-MRSA為88株，占29.73%。感染標本主要來源于兒科和皮膚科、骨科，說明CA-MRSA主要感染兒童、健康人群，且以感染皮膚軟組織為主。根據SCCmec分型主要分為兩個型別，分別是SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型，其中SCCmecⅣ型48株，SCCmecⅤ型36株，與國內其他地區的文獻[8]報道結果基本一致。而李敏豪等[9]的研究表明，CA-MRSA的SCCmec分型為Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型，可能是由于地理區域不同，導致的CA-MRSA的基因分型有所不同，也可能是由于病史資料的統計方法不同，致使一部分HA-MRSA判斷為CA-MRSA。本實驗中的4株未定型CA-MRSA可能為SCCmec亞型，需要進一步鑒定。

MRSA耐藥機制主要是由于編碼青霉素結合蛋白(PBPs)的基因發生變化所致。MRSA的多重耐藥特點與擁有的SCCmec結構存在聯系。SCCmec主要有5個型別, HA-MRSA基因型別為SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型, CA-MRSA 基因型別多為Ⅳ型和Ⅴ型。SCCmec基因型與 MRSA 的流行背景有關, 不同地區的 SCCmec可能不同, 不同遺傳背景的克隆株攜帶的 SCCmec也可能不同，同時耐藥也存在顯著差異[10]。HA-MRSA通常多重耐藥嚴重，對β-內酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環素類、大環內酯類、林可霉素等多種抗菌藥物耐藥，通常僅對糖肽類敏感，目前萬古霉素是其最后一道防線[11]。CA-MRSA除mecA基因外很少攜帶其他耐藥基因，但隨著抗菌藥物的頻繁使用，CA-MRSA對各類抗菌藥物的耐藥性也在不斷增強。

本研究顯示，84株CA-MRSA對青霉素和苯唑西林100%耐藥，但未發現對萬古霉素、利奈唑胺、替加環素的耐藥菌株。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA對左氧氟沙星、環丙沙星、利福平的耐藥率比較，差異有統計學意義，且耐藥率比較低，對其余9種抗菌藥物的耐藥率均無差別，且耐藥率相對偏高。說明不同的SCCmec基因型別的菌株對抗菌藥物的耐藥性有一定的差別，可能是由于不同的SCCmec基因攜帶了不同的耐藥基因所致[12]。在美國，克林霉素是皮膚軟組織感染門診治療的推薦用藥[13]，而本地區克林霉素耐藥率高達50%，說明在門診治療中要根據具體情況選擇合適的抗菌藥物。本實驗中Ⅳ型和Ⅴ型CA-MRSA對大多數抗菌藥物的耐藥率均較劉小麗等[8]的研究要高，對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為66.67%、69.44%，對呋喃妥因的耐藥率分別為62.50%、58.33%，對紅霉素的耐藥率分別為66.67%，69.44%，說明本地區CA-MRSA的耐藥性比較嚴重。在臨床治療CA-MRSA感染過程中可聯合使用耐藥率較低的左氧氟沙星、環丙沙星、利福平，防止耐藥率的升高，同時不宜根據經驗用藥，要根據實驗室的藥物敏感性合理應用抗菌藥物。

綜述所述，本院CA-MRSA感染流行較嚴重，耐藥率較高，臨床醫生應引起高度重視。

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(本文編輯：左雙燕)

SCC mec genotyping and antimicrobial susceptibility of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus

NIURui-bing,GUOLi-ping,WANGXin-gang,DUANBao-sheng,BATe-er

(OrdosCentralHospital,Ordos017000,China)

Objective To investigate the types of staphylococcal cassette chromosomemec(SCCmec) gene and antimicrobial resistance of community-acquired methicillin-resistantStaphylococcusaureus(CA-MRSA) isolated from outpatients and inpatients in a hospital.Methods MRSA strains isolated between May 2011 and August 2015 in a hospital and the relevant case data were collected, polymerase chain reaction(PCR) method was used to identifymecA gene of MRSA and SCCmecgene of CA-MRSA, antimicrobial susceptibility testing of CA-MRSA were performed and analyzed.Results A total of 305 MRSA isolates were collected, 296 of which weremecA positive, 29.73%(88/296) were CA-MRSA. The genotyping of CA-MRSA showed that 48 strains were SCCmectype Ⅳ, 36 were SCCmectype V, the other 4 strains were undefined. Antimicrobial susceptibility testing results showed that susceptibility rates of CA-MRSA to vancomycin, linezolid, and tigecycline were all 100%, resistance rates to penicillin and oxacillin were both 100%; resistance rates of SCCmectype IV and SCCmectype V CA-MRSA strains to levofloxacin, rifampicin, and ciprofloxacin were all significantly different (allP<0.05), to ampicillin/sulbactam, furantoin, and erythromycin were all >58%.Conclusion The main SCCmectype of CA-MRSA are type IV and type V in this hospital, antimicrobial resistance rate is high, clinicians should pay high attention, and use antimicrobial agents according to antimicrobial susceptibility testing results.

Staphylococcusaureus; community-acquired methicillin-resistantStaphylococcusaureus; CA-MRSA; SCCmecgenotyping; drug resistance, microbial; rational antimicrobial use

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.001

2016-06-25

內蒙古自治區自然科學基金面上項目(2013MS1116)；內蒙古自治區衛生和計劃生育委員會醫療衛生科研計劃項目(201302161)

牛瑞兵(1986-)，男(漢族)，山西省興縣人，主管檢驗師，主要從事微生物與免疫學疾病的研究。

段寶生 E-mail:erdsdbs@163.com

R378.1+1 R969.3

A

1671-9638(2016)12-0897-05