轉錄因子在誘導多能干細胞神經分化中的作用研究

胡傳欽 周麗萍 林德菊 余勤★

·綜述·

轉錄因子在誘導多能干細胞神經分化中的作用研究

胡傳欽 周麗萍 林德菊 余勤★

2006年，Takahashi等[1]通過逆轉錄病毒為載體，將四種轉錄因子（Oct3/4、Soχ2、Klf4和c-Myc）轉染至小鼠成纖維細胞中，得到一種具有多能特性的細胞，被稱為誘導多能干細胞（iPSCs）。iPSCs在許多方面與胚胎干細胞相似度較高，諸如DNA甲基化、基因表達譜、表面抗原、表觀遺傳狀態及端粒酶活性等方面，并且具有向三胚層分化的特點[2]，因此，Yamanaka憑借iPSCs的成果獲得了2012年諾貝爾醫學或生理學獎。目前，科學家們已經利用iPSCs獲得了胰島細胞、干細胞、神經細胞等不同類型的細胞，而且成功利用iPSCs培養出了小鼠成熟個體，證明iPSCs具有與ESCs一樣的全能性。同時，iPSCs又具有獨特的優越性，其成功地規避了倫理道德問題，消除潛在的免疫排斥反應，給細胞移植技術提供了可靠的原材料。

近年來，以阿爾茨海默病、帕金森病為代表或以中樞神經系統功能障礙為主的神經系統疾病越來越引起人們的關注，干細胞通過自我增殖和分化成神經元細胞以替代已凋亡的神經細胞成為臨床研究的熱點。研究證明，iPSCs在特定的細胞因子作用下能分化成神經細胞[3]。蘇肖英等[4]發現神經生長因子（NGFs）顯著促使神經干細胞（NSCs）分化為神經元并促進相關信號因子磷酸化，從而促使NSCs向神經細胞分化。Atsukod等[5]發現一些生長因子在視神經退化過程中具有不同的表達變化。可見細胞因子在神經細胞的生長、增殖和凋亡過程中都扮演著不可或缺的角色。本文就iPSCs向神經細胞分化過程中發揮主要作用的細胞因子做一綜述。

1 bHLH基因家族

堿性螺旋-環-螺旋基因家族（bHLH）能編碼多種轉錄蛋白因子，通過這些蛋白，細胞能夠向不同方向分化。bHLH家族基因上游富含堿性氨基酸可與相應的基因片段結合，在基因的轉錄方面具有調控作用。

1.1 Hes1因子 Hes因子是bHLH轉錄抑制因子的一種，其與動物神經系統發育有關。迄今為止，研究者共發現了七種Hes基因，其中Hes1在成神經分化過程中具有重要作用。Hes1基因編碼的Hes1蛋白具有一個特殊的保守bHLH結構域，能與一些正調控的轉錄因子結合。例如與促進神經元分化的Ascl1結合，抑制Ascl1的表達而發揮負向調控作用，其在細胞內的高表達能使神經祖細胞保持未分化狀態；而適當表達則可以控制神經干細胞進行不同功能的分化。Hes1蛋白在不同的部位具有差異性表達，例如成年小鼠海馬中的齒狀回和CA3區的表達不同。Akihiro等[6]在研究黃芩苷對人iPSCs向神經元方向分化的過程中發現，其能促進iPSCs向神經元分化和抑制向膠質細胞分化，減少細胞中Hes1蛋白的表達水平，當Hes1蛋白含量降低后，對iPSCs的抑制作用隨之減弱，最后促進iPSCs向神經方向分化。

1.2 Neurogenin（Ngn）基因 Ngn同樣是bHLH家族基因中的一員，主要在神經前體細胞中表達，控制著神經前體細胞的發育。Ngn基因家族主要包括Ngn1、Ngn2，具均能在神經系統中得到表達，而且人類和其他哺乳動物不完全相同。在哺乳動物大腦皮質發育過程中，Ngn1和Ngn2的表達具有差異性，表達部位和時期也不相同。Ngn與神經元的分化成熟密切相關，在神經發生的早期和晚期都需要Ngn1的表達，而Ngn2只在早期是必需的。Ngn1和Ngn2能與bHLH蛋白形成二聚體，通過堿性區域與帶電的DNA序列結合，啟動組織特異性表達。Ngn1基因編碼的蛋白影響神經細胞的分化過程，而且在不同種類動物中具有不同的表達方式，其表達的特異性受到增殖的神經祖細胞的限制。同時，Ngn1的表達伴隨著NSCs分化為神經元的增加而增加，而當細胞中β-catenin基因受到抑制時，Ngn1的表達會有所減少。同時研究發現，Ngn2基因在調控星形膠質細胞分化為神經元方面具有重要作用，主要通過促進神經蛋白的表達來實現，屬于bHLH家族的激活型基因。

2 神經營養因子（NTF）

NTF作為一種多肽，能促進神經細胞存活、生長、分化，并且與受體結合。其家族成員包括神經生長因子、腦源性神經營養因子、神經營養因子3/4等。近年來，又發現了睫狀神經營養因子家族（CNTF）、成纖維細胞生長因子（IGF）和表皮生長因子（EGF）等。神經營養因子是一種小分子堿性蛋白，在成熟神經系統中，在神經元的死亡、突觸的可塑性、神經遞質傳遞和神經再生等方面均有影響。

2.1 神經生長因子（NGF） NGF是發現于神經家族生長發育早期，對神經元的生長、發育、繁殖具有促進作用的。

NGF細胞內，與效應細胞的膜受體結合，沿軸逆向轉運，經軸突至細胞核，引起生物學效應。在神經性疾病的研究中，NGF在疾病的發生、發展和預后中都有重要的作用。在神經干細胞的誘導分化上，NGF處理后的干細胞激活細胞內的PI3K/Akt信號通路，使PI3K激酶被激活，促使Akt轉位于質膜上，轉位于質膜上的Akt通過其308位蘇氨酸和473位絲氨酸的磷酸化而被激活[7]，這些研究成果證明，NGF能調控細胞內神經分化和決定細胞的命運。

2.2 血管內皮生長因子（EGF） EGF作為一種同源二聚體糖蛋白，在結構上具有高度的保守性，在細胞分泌、血管內皮細胞增殖和增加血管通透性過程中具有重要作用。其作用于神經EGF受體，參與神經軸突的生長，影響神經細胞的分化，維持神經細胞的存活，并且保護神經元。在體外，EGF能夠促進人胚胎干細胞神經分化，通過激活Notch信號通路而發揮促神經干細胞增殖作用。研究發現EGF對海馬等腦組織內神經發生區的神經干細胞有促生長、提高存活率和趨化作用[8]。

3 其他家族影響因子

3.1 Nanog影響因子 Nanog基因是原始生殖細胞及胚胎干細胞表達的重要轉錄因子，維持干細胞全能型和增殖分化。研究發現胚胎發育的早期，Nanog不表達于早期卵裂階段，而是在桑椹胚階段先表達[9]。而且，Nanog基因在胚胎干細胞內高表達，誘導胚胎干細胞分化以后，Nanog的表達則會出現下調情況，表明維持胚胎干細胞的全能型與Nanog基因的表達有密切關系。自Takahashi等[1]通過病毒載體感染成纖維細胞而得到iPSCs后，發現其具有和胚胎干細胞類似的特性，比如增殖、多能性、表面標記和向三胚層分化等方面。有研究者將小鼠iPSCs移植至小鼠體內的囊胚腔，最后得到了具有繁殖能力的新成熟個體[10]。Liang等[11]發現在胚胎發育的早期，受到Nanog啟動子轉換信號Nodal/Smad2的調節，Nanog基因能夠維持外胚層多能性的穩定。由于iPSCs與胚胎干細胞的相似性，誘導iPSCs的分化表達后，Nanog基因會隨著分化成熟度而降低表達。

3.2 Sox2影響因子 20世紀90年代，科學家在研究決定性別的SRY基因是發現了一段保守的核苷酸序列，隨后學術界將與其相關的一類相似基因命名為Sox基因。隨著研究的深入，科學家發現Sox擁有多種亞族基因，這些基因在個體發育過程中發揮著重要作用，在性別決定和胚胎、神經系統、循環系統的發育均有影響。其編碼的蛋白質具有結合DNA的能力，是一類重要的轉錄調控因子。Sox基因家族種類眾多，例如Sox4基因是B淋巴細胞增殖的重要因素，Sox1在胚胎期能調控感覺神經元的發育。在神經系統中，和神經系統增殖分化有關的為Sox2。作為Sox轉錄因子家族成員之一，Sox2在細胞神經發育早期對維持自我更新及多向分化潛能具有關鍵性的調節作用，對其自身的分化命運具有重要的調控作用。Peretz等[12]發現小鼠后腦神經干細胞池中，Sox2具有重要的調控作用。在小鼠后腦發育初期，Sox2+細胞的表達具有統一性；但是隨著發育過程的不斷進行，部分細胞會呈現一種動態的Sox2高表達，并且這些細胞的表面抗體（HBs）會受到抑制。研究還發現后腦區域中，Sox2調控神經干細胞或神經祖細胞分化過程中，一些細胞因子（如Pax6、FGF3、PLZF1、Id1等）在不同細胞、組織中表達發育順序相一致，而且在不同的實驗動物中具有相同的趨勢[13-14]。

3.3 Oct4影響因子 Oct4基因是POU轉錄因子家族中的一員，主要表達于胚胎干細胞、生殖干細胞中，其在維持胚胎干細胞的多能性和自我更新方面發揮著關鍵作用。目前，Oct4基因發現較早，是一種高度保守的基因，在人和小鼠方面研究較多，有維持胚胎干細胞多能性和自我更新的作用。Zhou等[15]發現Oct4轉錄因子在誘導神經前體細胞重編程為iPSCs過程中，能提高重編程的有效率。同時在重編程過程中，穩定的β-catenin蛋白的表達，可以使Oct4與細胞凋亡因子Survivin結合，從而加強重編程后iPSCs的存活率。Han等[16]發現利用轉錄因子Oct4等誘導的iPSCs能夠在體外成功分化為神經干細胞，并且移植誘導后的神經干細胞至PD大鼠的腦紋狀體能是大鼠的體外回旋功能試驗得到提高，并且在體內能夠分化為神經元等細胞，說明Oct4轉錄因子參與誘導iPSCs向神經方向分化。

4 iPSCs成神經誘導分化的前景和展望

iPSCs在干細胞和生物學的研究領域具有里程碑式的意義，近年來取得一系列重大突破，使iPSCs臨床應用又向前推進了一步。在iPSCs的神經分化方面，科學家們研究了不同細胞因子對iPSCs分化為神經細胞過程中的作用，為臨床研究奠定了理論基礎。目前已知的能對干細胞向神經分化的細胞因子種類仍然有限，相信隨著研究的不斷深入，iPSCs在神經系統疾病的臨床治療中將會展現不可估量的應用前景。

[1] Takahashi,Yamanaka．Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors．Cell,2006,126(4):663-676．

[2] Takahashi,Tanabe K,Ohnuki M,et al．Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors．Cell,2007,131(5):861-872．

[3] Osama M,Shan PY,Chen DD,et al．Efficient neuronal differentiation of mouse ES and iPS cells using a rotary cell culture protocol．Differe-ntiation,2013,86(1):149-158．

[4] 蘇肖英,汪海濤,孟茜,等．神經生長因子誘導神經干細胞分化的作用機制探討．廣東醫學,2012,33(1):44-48．

[5] Atsukod K,Kazuhiko N,Guo XL,et al．Neuroprotection,Growth Factors and BDNF-TrkBSignalling in Retinal Degeneration．International Journal of Molecular Sciences,2016,7(27):325-328．

[6] Akihiro M,Kohei S,Hironobu N,et al．Neuronal differentiation of human iPS cells induced by baicalin viaregulation of bHLH gene expression．Biochem Biophys Res Commun,2015,465(3):458-463．

[7] CarmelietP．Blood vessels and nerves:common signals,pathways and diseases．Nat Rev Genet,2003,4(9):710-720．

[8] GradwohlG,Fode C,Guillemot F．Restricted expression of a novel murine atonal-related bHLH protein in undifferentiated neural precursors．Dev Biol,1996,180(1):227-241．

[9] Yamagchi S,Kimura H,Tada M,et al．Nanog expression in mouse germcell development．Gene Expr Pattems,2005,5(5):639-646

[10] Zhao XY,Li W,Lv Z,et al．iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation．Nature, 2009,461(7260):86-90．

[11] Liang TS,Shinpei Y,Kunio H,et al．Nanog co-regulated by Nodal/Smad2 and Oct4 is required for pluripotency in developing mouse epiblast． Developmental Biology,2014,392(5) 182-192

[12] Peretz Y,Eren N,Kohl A,et al．A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Soχ2．BMC Biol,2016,14:57-61．

[13] KeeY,BronnerFM．Temporally and spatially restricted expression of the helix-loop-helix transcriptional regulator Id1 during avian embryogenesis．Mech Dev,2001,109(2):331-335．

[14] SelaD,Kayam G,Wilkinson DG．Boundary cells regulate a switch in the expression of FGF3 in hindbrain rhombomeres．BMC Dev Biol,2009,9:16．

[15] Zhou SX, Liu YN, Feng RP, et al． Survivin Improves Reprogramming Efficiency of Human NeuralProgenitors by Single Molecule Oct4． Stem Cell International,2016,1155(10):11-22．

[16] Han FB,Wang wei,Chen BX,et al．Human induced pluripotent stem cell-derived neurons improve motor asymmetry in a 6-hydroxydopamine-induced rat model of Parkinson's disease．Cytotherapy, 2016, 17(5):665-679．

國家自然科學基金（31570994），浙江省自然科學基金（LY15C100001）

310053 浙江中醫藥大學生命科學學院

*通信作者