干細胞在內耳毛細胞再生中的應用

吳佳源 劉俊?

·綜述·

干細胞在內耳毛細胞再生中的應用

吳佳源 劉俊?

根據世界衛生組織統計，全球約有2.78億人患有耳聾疾病［1］。永久性聽力損失是由于耳蝸內的毛細胞喪失了再生能力［2］。目前恢復因耳蝸毛細胞丟失而引起的中重度聽力損失的唯一方法是使用人工耳蝸或助聽器直接刺激聽神經。但其使用受限于復雜的聽力損傷機制和組織損傷程度［3］。理想的解決方案是用干細胞、基因、藥物治療阻止耳蝸毛細胞的丟失或再生耳蝸毛細胞和螺旋神經節神經元［4］。本文對干細胞再生耳蝸毛細胞和螺旋神經節神經元作如下綜述。

1 內耳干細胞

在哺乳動物中，毛細胞的生成只出現在早期胚胎形成過程中相對較短的時間內。在成熟的Corti器里，一旦毛細胞死亡，其便不會再生［5］。盡管哺乳動物內耳不能再生丟失的毛細胞，但仍然有證據表明哺乳動物內耳具有某種再生能力的細胞，因可以從前庭感覺上皮和新生的耳蝸中分離出這種細胞［6］。這些細胞被稱之為內耳胚胎干細胞。

非哺乳脊椎動物的內耳胚胎干細胞存在于內耳感覺上皮區且這些細胞可以產生一個顯著再生反應。與此相反，哺乳動物的內耳干細胞僅存在于年輕內耳感覺上皮，其數量會隨時間的推移顯著降低（耳蝸甚至會降到零）。雖然這些細胞數目較少，僅占一個橢圓囊細胞中0.025%的細胞，但其擁有干細胞最重要的特征即自我更新和具有多功能性［7］。最近的一些研究發現，哺乳動物幸存的支持細胞也可以被誘導橫向分化成新的毛細胞［8］。哺乳動物耳蝸的支持細胞和鳥類耳蝸毛細胞來源于相同的祖細胞。然而在成年哺乳動物中，對于耳蝸毛細胞的損傷，這些支持細胞并不能做出反應而自發的分化成毛細胞［9］。這可能是由于相應信號的缺乏或某種抑制劑的存在而導致成年哺乳動物前庭上皮的低再生能力［10］。

在內耳發育過程中細胞周期抑制因子起著重要作用。例如細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（CDK抑制蛋白）—p27kip1及p19Ink4d。p27kip1的表達在毛細胞的分化過程中逐漸下降，而在成熟Corti器的有絲分裂后期支持細胞中卻持續表達。這表明p27kip1的一個主要作用便是維持支持細胞的靜息狀態。這也暗示抑制p27kip1的表達可以促進感覺細胞的前體細胞增殖，同時對于哺乳動物聽力器官中毛細胞再生的誘導提供一條重要途徑。p19Ink4d的作用 跟p27kip1一樣，其共同作用維持著已分化的感覺細胞的靜息狀態［11］。內耳毛細胞增殖同樣也受成視網膜細胞瘤蛋白（RB蛋白）控制。RB蛋白的主要作用同樣也是維持細胞的靜息狀態［12］。研究發現抑制老鼠未分化毛細胞的前體細胞RB蛋白的激活可以導致耳蝸毛細胞的擴增及新的毛細胞的生成［13］。臨時或永恒抑制這些細胞周期抑制因子也許會生成新的毛細胞和支持細胞，這也給治療感音神經性耳聾提供一種新的治療方法。ATOH1基因編碼轉錄因子Math1有助于神經元和耳蝸毛細胞的生成，當一些哺乳動物的支持細胞的轉錄因子Math1被過表達時，這些細胞便會改變形態以增加耳蝸毛細胞纖毛的數量，同時也會促進腦干誘發電位的功能恢復［14］。近來研究發現notch信號在毛細胞和支持細胞的分化過程中起至關重要的作用［15］。當notch信號被抑制時，新的毛細胞可以被誘導生成，還發現噪音刺激引起的聽力損傷可以被部分恢復［14］。

因此在耳聾動物的耳蝸里對于細胞周期抑制因子、ATOH1基因和notch信號通路的調控可能是一種讓毛細胞再生的有效方法。

2 外耳干細胞

2.1 骨髓間充質干細胞 骨髓間充質干細胞（也稱為骨髓基質細胞）是多能的且能在體內和體外修復組織。骨髓間充質干細胞可以產生骨和軟骨且還能分化成肌細胞、肝細胞和膠質細胞及最重要的神經細胞。由于這些原因，間充質干細胞是一種用于干細胞替代療法的有前景的細胞來源。

Jae-Hong Lee等從SD大鼠骨髓中分離得到的骨髓間充質干細胞進行體外培養14d后發現，間充質干細胞分化成神經細胞和施萬細胞的比例遠高于毛細胞［16］。Sujeong Jang等成功將神經誘導的人類間充質干細胞移植入成年雌性豚鼠耳蝸，發現被植入的細胞主要存在于受損耳蝸的螺旋神經節、Corti器及耳蝸神經，且這些細胞可以存活8周。在注入NI-hMSCs后的成年雌性豚鼠與注入平衡鹽溶液的對照組比較，發現前者的螺旋神經節細胞的數目有所增加，被嫁接的人類間充質干細胞也表達一種成熟的神經元標志—MAP2。這表明人類骨髓間充質干細胞可以分化成神經細胞且可以替代丟失的螺旋神經節細胞［17］。因此間充質細胞可以被用來治療因螺旋神經節退化而導致的神經性聽力損失和提高人工耳蝸植入的成功率［18］。

2.2 神經干細胞 成人神經干細胞具有自我更新能力和多能性。神經干細胞可以從發育中的大腦區域中分離獲得，包括大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、螺旋神經節神經元和嗅覺上皮［19-20］。移植的神經干細胞被證明可以遷移至腦損傷部位并分化成原生的細胞類型，諸如少突膠質細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞、皮質神經元和脊髓神經膠質和神經元。這些結果表明，神經干細胞既能替換損壞的神經組織又能恢復損傷后的功能。

Parker等將克隆神經干細胞（cNSCs）注入至聽力受損的小鼠和豚鼠的鼓階中，6周以后，在兩組動物模型中的一些cNSCs均出現在整個耳蝸中并顯現出神經耳蝸組織（例如：螺旋神經節神經元，衛星細胞和雪旺細胞）和柯蒂器細胞（柱細胞、支持細胞和毛細胞）的形態學，蛋白質和基因的特征。被植入的cNSCs在形態學和蛋白質表達上的不同取決于其在耳蝸內所處的位置，這表明耳蝸內的微環境對cNSCs的發展起到重要作用。一旦這個神經干細胞系遷移至耳蝸內，接受來自微環境的信號后，這些細胞便表達由內耳細胞表達的細胞基因命運程序，并對該程序進行正反饋和負反饋的調節以達到平衡。這些結果表明干細胞具有發展潛力。同時也表明成年哺乳動物耳蝸內還保留著一些信號，這些信號對于干細胞沿著耳蝸的表型分化是必要的，盡管這些信號并不能作用于內耳的細胞群從而再生這些細胞［21］。

2.3 胚胎干細胞 胚胎細胞的巨大潛力在于其在無限增長的同時還能保持多能性，且可以分化成所有三個胚層的細胞。人類干細胞可以被用來治療較多疾病，比如帕金森疾病、脊髓損傷和糖尿病。然而其生產需要摧毀胚胎，這便會在某些群體中引發強烈的道德反對。此外，使用這些細胞進行同種異體移植可能會引發免疫排斥且需要使用免疫抑制劑。在2006年，由于山中伸彌等在實驗上的突破，這些問題似乎已經被規避。作者介紹一種方法即通過人為表達四種基因（轉錄因子OCT4，MYC，SOX2和KLF4）重新編程成纖維細胞使之進入多能狀態（類似胚胎干細胞）［22］。

2.4 人工誘導的多功能干細胞 盡管誘導的多功能干細胞（iPSCs）的治療前景巨大，但這可能是一個錯誤忽視胚胎干細胞，以完全專注在iPSCs。可以預期的是控制iPSCs分化的信號和規則和管理人類胚胎干細胞的信號和規則是一樣的。然而，已有證據表明iPSCs分化成特地譜系細胞的成功率是高度可變的［23］，且其可能遭受大量基因組的變異。

Niliksha Gunewardene等用兩種誘導的多功能干細胞（hiPSCs）和一種人類胚胎干細胞（hESCs），使其朝一個特定的感覺神經細胞譜系（neurosensory lineage）分化。實驗發現，在體外35d，hiPSC和hESCs衍生的感覺神經祖細胞均有感覺神經標志物的高表達水平。此外，從該實驗中所產生的神經元被認為是有電活性的。雖然所有的細胞系均產生有功能的感覺神經樣祖細胞，但與hESCs相比較，hiPSCs在神經標志物表達水平上是可變的。總體而言，這些結果表明，hiPSCs有能力分化成感覺神經細胞系，但必須提高hiPSCs分化成所需要譜系的一致性［24］。

3 最適合用于再生內耳的干細胞

理論上，胚胎干細胞是對于內耳細胞的恢復最好的選擇。然而，有證據表明一些胚胎干細胞譜系能夠發展成為腫瘤，在細胞移植后產生不良組織。另外，獲取胚胎干細胞需要破壞胚胎，這在倫理角度上受質疑。

神經干細胞可以從器官獲取，這在倫理上似乎是被認可的。然而，一旦神經干細胞只在大腦深部區域被發現，那么對于神經干細胞有限的獲取方式會阻礙其臨床應用。另一方面，間充質干細胞的獲取較容易且在其分化過程中也可以產生神經元細胞。再加上其能產生神經營養因子，它們能增加神經元的數量且對螺旋神經節有支持保護作用，這也潛在的提高電子耳蝸的植入效率［25］。但骨髓間充質干細胞移植進耳蝸后存活的比例較低，Matsuoka等把BMMsC移植進蒙占沙鼠耳蝸內，發現鼓階注射的細胞存活率僅為0.54‰，蝸軸注射的存活率僅為0.59 ‰，而存活的細胞中也僅有少部分能分化為內耳功能細胞表型［26］。

對比神經干細胞和成人內耳干細胞在體外分化成內耳毛細胞的實驗，它們之間有兩個不同：（1）內耳干細胞的分化能力是神經干細胞的100倍。（2）內耳干細胞比神經干細胞能更完全的分化成毛細胞［27］。

動員內源性干細胞為替代損壞的內耳毛細胞提供了一種新方式。動員宿主干細胞不需要像移植外來細胞（如胚胎干細胞和非胚胎干細胞）進入耳內那樣復雜，避免了移植方式的選擇，移植過程中造成的手術創傷，移植排斥反應，無節制移植細胞的增殖和腫瘤形成。因此內耳干細胞對于耳蝸毛細胞的修復可能是最好的選擇［28］。

4 總結

目前，用干細胞移植治療來恢復聽力在臨床上尚未得到應用。對于聽力的恢復，不可能使用單一的方法，需要對多種治療方法進行聯合以提高治療效率，這些方法包括對細胞周期機制的基因操作，通過基因療法誘導毛細胞的生成，干細胞移植進入受損的耳蝸、耳蝸神經及耳蝸核神經元。由于毛細胞可以從支持細胞中再生，通過橫向分化再生毛細胞的機制將會明顯提高治療聽力損失措施的潛力［29-30］。

［1］ Chen W,Johnson SL,Walter M,et al． Human Fetal Auditory Stem Cells Can Be Expanded In Vitro and Differentiate Into Functional Auditory Neurons and Hair Cell-Like Cells． Stem Cells,2009,27(5):1196-204．

［2］ Huawei L,Hong L,Stefan H． Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear． Nat Med, 2003,9:1293-1299．

［3］ Sng J,Lufkin T． Filling the silent void:genetic therapies for hearing impairment． Genet Res Int． 2012,2012:748698．

［4］ Kopecky B,Fritzsch B． Regeneration of hair cells:making sense of all the noise． Pharmaceuticals, 2011,4:848-879．

［5］ Okano T,Kelley MW． Stem cell therapy for the inner ear:recent advances and future directions． Trends in Amplification,2012,16(1):4-18．

［6］ Ronaghi M,Nasr M,Stefan Heller． Concise Review:Inner Ear Stem Cells-An Oxymoron,but Why? Stem Cells, 2012,30(1):69-74．

［7］ Okano T,Kelley MW． Stem cell therapy for the inner ear:recent advances and future directions． Trends in Amplification, 2012,16(1):4-18．

［8］ Sinkkonen ST, Chai RJ, Jan TA, et al． Intrinsic regenerative potential of murine cochlear supporting cells． Sci． Rep,2011．

［9］ Almeida-Branco MS,Cabrera S,Lopez-Escamez JA． Perspectives for the treatment of sensorineural hearing loss by cellular regeneration of the inner ear． Acta Otorrinolaringologica Espanola,2014, 66(5):286-295．

［10］ Liu Q,Ping C,Wang J． Molecular mechanisms and potentials for differentiating inner ear stem cells into sensory hair cells．Developmental Biology,2014,390(2):93-101．

［11］ Almeida-Branco MS, Cabrera S, Lopez-Escamez JA．Perspectives for the treatment of sensorineural hearing loss by cellular regeneration of the inner ear． Acta Otorrinolaringologica Espanola, 2014,66(5):286-295．

［12］ Mantela J,Jiang Z,Ylikoski J,et al． The retinoblastoma gene pathway regulates the postmitotic state of hair cells of the mouse inner ear． Development,2005,132(10):2377-2388．

［13］ Weber T,Corbett MK,Chow LM,et al． Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells． Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(2):781-785．

［14］ Mizutari K,Fujioka M,Hosoya M,et al． Notch Inhibition Induces Cochlear Hair Cell Regeneration and Recovery of Hearing after Acoustic Trauma． Neuron,2015,77(1):58-69．

［15］ Kiernan AE． Notch signaling during cell fate determination in the inner ear． Semin． CellDev．Biol,2013,24:470-479．

［16］ Lee JH,Kang WK,Seo JH,et al． Neural Differentiation of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells:Applicability for Inner Ear Therapy． Korean Journal of Audiology,2012,16(2):47-53．

［17］ Hickox A E． Noise-induced cochlear neuronal degeneration and its role in hyperacusis -and tinnitus-like behavior． Massachusetts Institute of Technology,2013．

［18］ Zhang PZ,He Y,Jiang XW,et al． Stem cell transplantation via the cochlear lateral wall for replacement of degenerated spiral ganglion neurons． Hear Res 2013,298:1-9．

［19］ Tucker ES,Lehtinen MK,Maynard T,et al． Proliferative and transcriptional identity of distinct classes of neural precursors in the mammalian olfactory epithelium． Development 2010,137:2471-2481．

［20］ Ogawa T, Takezawa K, Shimizu S, et al． Valproic acid promotes neural regeneration of olfactory epithelium in adult mice after methimazole-induced damage． Am J Rhinol Allergy 2014, 28:e95-99．

［21］ Yang H,Chen X,Gao Z． Recent progresses in stem cell research and hearing restoration． Journal of Otology,2008,3(1):1-8．

［22］ Bai Q, Desprat R, Klein B,et al． Embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells? A DNA integrity perspective． Curr Gene Ther, 2013,13:93-98．

［23］ Hu BY, Weick JP, Yu J, et al．Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency． Proc Nat Acad Sci USA． 2010,107:4335-4340．

［24］ Gunewardene N,Bergen NV,Crombie D,et al． Directing human induced pluripotent stem cells into a neurosensory lineage for auditory neuron replacement． Bioresearch Open Access,2014,3(4):162-75．

［25］ Naito Y,Nakamura T,Nakagawa T,et al． Transplantation of bone marrow stromal cells into the cochlea of chinchillas． Neuroreport,2004,19,15(1):1-4．

［26］ Akihiro J, Matsuoka MD PhD, Kondo T, et al． In Vivo and In Vitro Characterization of Bone Marrow-Derived Stem Cells in the Cochlea． Laryngoscope,2006,116(8):1363-1367．

［27］ Li H,Liu H,Heller S． Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear． Nat Med, 2003,9(10):1257-1259．

［28］ Elbana AM,Abdel-Salam S,Morad GM,et al． Endogenous bone marrow stem cell mobilization in rats:Its potential role in homing and repair of damaged inner ear． Egyptian Journal of Ear Nose Throat & Allied Sciences,2015,16(1):55-67．

［29］ Batts SA,Raphael Y． Transdifferentiation and its applicability for inner ear therapy． Hear Res,2007,227:41-47．

［30］ Andl T,Murchison EP,Liu F,et al． The miRNA-processing enzyme dicer is essential for the morphogenesis and maintenance of hair follicles． Curr Biol,16:1041-1049．

浙江省教育廳（Z201119721）；浙江省衛生廳（200913120）

310053 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院（吳佳源）310006 浙江省中醫院（劉俊）*通信作者