腦梗死相關診斷性生物標記物研究進展

高碩君，張祥建，2，3，張培培

在目前臨床實踐中，卒中的診斷主要依靠臨床醫師對癥狀、體征的判斷及影像學檢查，但是許多疾病如偏頭痛、癇性發作等可能與卒中有類似的臨床表現，影像學客觀檢查也有一定的局限性。卒中包括出血性及缺血性兩種類型，疾病早期，顱腦電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）是鑒別腦梗死與腦出血的唯一依據，但是在腦梗死患者的CT檢查中，僅有不到1/3的患者在發病3 h內有相應的特征性表現[1-2]，磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）診斷腦梗死敏感性較高，但受到檢查時間及設備等限制，不適用于急診腦梗死患者。在過去的數十年中，隨著氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法、基因芯片、蛋白質芯片等科學技術的不斷進步，越來越多與腦梗死相關的診斷性生物標記物被發現，本文就這一問題目前有代表性的研究成果做出介紹。

美國國立衛生研究院將生物標記物定義為：一種能夠客觀檢測和評估的特征指標，能夠作為生理過程、病理過程及藥理過程的指示。用于輔助診斷腦梗死的生物標記物需具備以下條件：①高靈敏度，確保所有卒中患者可以被早期診斷并及時得到治療，同時對腦梗死及腦出血具有鑒別意義；②可以進行方便、快速地檢測，適用于缺少影像學檢查設備的基層醫療機構[3]。生物標記物檢測樣本組織來源也極為豐富，已有動物實驗取材包括血漿、血清、腦脊液、海馬、紋狀體、丘腦、中腦、白質、松果體以及嗅球，其中，血漿、血清及腦脊液為主要的樣本來源，其他組織來源取材復雜，且不適用于臨床實踐[4]。血液采集更方便，適合作為診斷性生物標記物的檢測對象[5]。DAMBINOVA等[6-7]比較短暫性腦缺血發作（transient ischemic attack，TIA）及腦梗死患者與健康志愿者血清N-甲基-D-天門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA-R）的自身抗體（autoantibodies，aAbs）水平，發現病例組aAbs濃度明顯高于對照組，血管事件發生后72 h內，血清中NMDA-R含量上調，針對NMDA-R，特別是NMDA-NR2A/2B亞型的aAbs水平對TIA及腦梗死的敏感度分別達到了95%及97%，對于鑒別腦梗死與腦出血也有一定意義。他們進一步研究發現直接檢測NMDA-R降解產生的抗原NMDA-NR2，在鑒別血管事件組與健康對照組時也表現出了較高的準確性。此外，還有研究發現血液中基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、鈣調蛋白（S100 calcium binding proteinb，S100b）等多種生物標記物在腦血管病事件發生后有相應改變，并在后經影像學證實的腦出血與腦梗死中表現出差異，在腦梗死的早期診斷中有一定意義[8]。隨后，人們又進一步研究多個生物標記物聯合組成的生物標記組，由于信息互為補充，生物標記組的診斷價值高于其中任何一種單一生物標記物。例如，采集患者癥狀發生后24 h內的血液，聯合檢測鈣調蛋白S100b及糖基化終產物的跨膜受體（soluble receptor for advanced glycation end product，sRAGE），與腦出血患者比較，腦梗死患者S100b水平降低而sRAGE水平升高，比較差異有統計學意義，但是檢測發病后6 h內血液，只有S100b表現出同樣的變化[9]。腦梗死病理生理機制復雜，涉及多種病理過程，且隨著時間變化，血液中各種物質水平也在不斷變化，不管是單一生物標記物還是多個聯合的生物標記組，其臨床實用性也有待進一步研究。

1 腦梗死相關蛋白質類生物標記物

2014年，人類第一份蛋白質組圖譜繪制成功，包含了由17 294個基因編碼的蛋白質和肽類[10]。隨著定量檢測方法由質譜法發展到氣相色譜-質譜法及液相色譜-質譜法，以及蛋白芯片等科學技術不斷進步，腦梗死的蛋白質組學研究有新的成果。SHARMA等[11]利用多種同位素標記及高效液相色譜-質譜法對腦梗死患者血清進行定量蛋白質組學分析，并探究相關病理生理學機制。他們發現了389種蛋白質，其中2/3包含特定的信號肽序列，并且通過與健康志愿者血清比較發現，60種蛋白質在腦梗死患者血清中表達有1.5倍以上的變化，其中25種表現為含量增多，35種含量減少。并進一步探究多種蛋白質的功能，例如已有研究顯示與冠心病發生相關的血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF），也與腦梗死患者內皮細胞功能紊亂相關，vWF在腦梗死患者血清中有1.8倍升高。除此之外，腦梗死相關蛋白質主要分類包括炎癥介質、神經保護介質、膜神經調節蛋白質、分泌性蛋白質、載脂蛋白。最后篩選出包括vWF、血管性血友病因子裂解蛋白酶（von Willebrand factor cleaving protease，ADAMTS13）、鈣調蛋白（S100 calcium binding protein A7，S100A7）的生物標記組對診斷腦梗死有一定意義[11]。這項研究較為全面地進行了腦梗死蛋白質組學分析，但是研究的局限在于納入受試者沒有限制腦梗死的發病時間，不能明確蛋白質在疾病哪個時期發生變化，新生蛋白質組（nascent proteomics）概念的提出則對全蛋白質組這一方面做出了補充。新生蛋白質組由在某一時間段內新合成的蛋白質組成，舉例來說，TIA的幾個小時內，在腦組織中新合成的蛋白質，也可以是人工培養神經元細胞在缺血缺氧的數小時內新合成的蛋白質[12]。由于血液中蛋白質種類很多，即使未來能夠繪制腦梗死全蛋白質組學圖譜，但是要明確每種蛋白質參與的病理生理過程及相關分子機制是非常困難的，也就不能明確治療靶點。與全蛋白質組相比，新生蛋白質組減少了要研究的蛋白質種類，更能反映腦梗死發生后蛋白質的動態變化，也更有利于進行后續蛋白質參與病理生理過程研究。2011年，第一次在人工培養的缺血缺氧神經細胞中檢測新合成蛋白質組，并且通過生物信息學分析，發現新生蛋白質組隨細胞過程發生變化，這一變化是全蛋白質組分析中沒有發現的。隨后，利用腦缺血小鼠模型進行了體內試驗，分析不同缺血條件下的新生蛋白質組及全蛋白質組，發現新生蛋白質組的特征及變化與全蛋白質組完全不同，并在腦梗死患者外周血中進行新生蛋白質組檢測，證實存在臨床意義[13-14]。相對于全蛋白質組，新生蛋白質組更為高效而直觀地反映蛋白質隨腦梗死病情發生的動態變化，值得在體內及體外實驗中進一步研究，得到腦梗死導致合成發生改變的蛋白質，從而指導腦梗死的診斷。

2 腦梗死相關核酸類生物標記物

目前研究較多的腦梗死相關核酸類生物標志物主要為微小RNA家族（microRNA，miRNA），miRNA是由基因編碼的內源性小RNA，由轉錄過程產生，雖然不翻譯成為蛋白質，但是幾乎參與大腦活動的每個過程，包括神經再生、神經發育、引起突觸可塑性變化的細胞反應等，在缺血缺氧的環境中，miRNA還與神經退行性病變及神經功能受損相關[15]。與RNA相比，miRNA更穩定且不容易分解，所以循環miRNA更適合作為輔助診斷腦梗死的生物標記物[16]。有研究發現在發病24 h內腦梗死患者外周血miRNA-107、-128b、-153水平與健康對照組相比有明顯升高[17]。另外有研究納入發病1周內的腦梗死患者，結果顯示循環miRNA-125b-2、-27a、-422a、-488及-627水平在腦梗死急性期升高，同時，這項研究還納入發病2～4個月后的腦梗死恢復期患者，與腦梗死急性期患者相比，恢復期患者循環miRNA水平更接近于健康對照組[18]。這一結果提示研究者們，隨著腦梗死病理過程的發展，循環miRNA水平發生變化后又趨于正常。那么循環miRNA不僅對首次發生的腦梗死診斷有指導意義，而且對有既往病史的患者再次發生腦梗死的診斷仍有輔助價值。由于多種miRNA在腦梗死后會發生變化，所以幾個miRNA聯合的生物標記組可能在診斷過程中具有較高特異度。隨著科學技術的不斷發展，繪制腦梗死患者循環miRNA表達譜已經不再是難以完成的任務，腦梗死患者大多數合并高血壓、糖尿病、肥胖等疾病，如何排除這些疾病的影響，提高miRNA診斷特異性需要進一步探究。另外，目前尚無研究顯示在腦梗死患者發病3 h內，循環miRNA會產生有意義的改變，所以，更多地探索應該關注于腦梗死癥狀發生早期發生變化的miRNA，以及它們的含量在腦梗死與腦出血患者的外周血中表現出的差異。

3 腦梗死相關其他生物標記物

除了上述的蛋白質及核酸類生物標記物外，還有研究發現單胺類神經遞質、脂類及有機酸等對腦梗死有診斷意義的生物標記物[4]。繼蛋白質組學及基因組學之后新興起的代謝組學，通過定性及定量檢測生物體系受到刺激后代謝產物的變化[19]，可以較為全面地反映機體內外環境的動態過程，但仍然需要更多地探索。

時間就是大腦，越早診斷腦梗死越能及時采取治療，預后也就越好。因此，發現腦梗死相關診斷性生物標記物的研究是非常必要的，利用生物標記物輔助臨床醫生在腦梗死早期做出診斷，將會使腦梗死患者及時得到有效救治，降低致殘率及死亡率，在臨床實踐中意義重大。

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