高危型人類乳頭瘤病毒E7促進宮頸癌變的分子機制研究進展

陳春琴 鄔素芳*

高危型人類乳頭瘤病毒E7促進宮頸癌變的分子機制研究進展

陳春琴 鄔素芳*

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。WHO于1992年宣布HPV病毒是引起宮頸癌變的首要因素。研究顯示E6、E7癌蛋白分別使腫瘤抑癌基因p53和pRb失去活性，最終引起細胞生長失控，發(fā)生癌變。在已存在E6基因基礎(chǔ)表達的HPV16感染細胞中，持續(xù)的E7基因表達對宮頸癌的維持是必要的［1］。高危型HPV病毒的E7基因表達的蛋白可干擾細胞周期、凋亡和染色體的穩(wěn)定，最終導致細胞永生化，逐步演變成宮頸癌［2］。 HPV E7作為宮頸癌發(fā)生、演進的主要致癌蛋白，已引起人們的高度重視。本文就HPV E7在宮頸癌致病機制中的研究進展做一綜述。

1 HPV E7蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

HPV屬乳多空病毒科，乳頭瘤病毒屬，病毒顆粒直徑約55nm，基因組約7.9 kb，相對分子質(zhì)量為5×106?；蚪M分為3個功能區(qū)：（1）早期區(qū)（E區(qū)）約4.5 kb，含E1，E2，E4~E7 6個亞區(qū)。E1參與病毒復制，其編碼蛋白具有ATP依賴性解旋酶的活性；E2參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，E2蛋白是主要的病毒轉(zhuǎn)錄因子；E4編碼晚期胞質(zhì)蛋白，與病毒成熟有關(guān)；E5具有較弱的轉(zhuǎn)化活性；E6和E7主要與細胞轉(zhuǎn)化及HPV的致癌性有關(guān)，編碼HPV最主要的癌蛋白。（2）晚期區(qū)（L區(qū)）編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。Ll高度保守，是主要的種特異性抗原；L2高度可變，是型特異性抗原。（3）長調(diào)控區(qū)（LCR）位于E區(qū)起始端與L區(qū)末端之間，一般為800~900kb，含有DNA復制與表達的調(diào)控元件。

高危型HPV E7基因編碼1個約100個氨基酸的小分子蛋白。E7蛋白包括3個CR區(qū)（con-served regions），CRl區(qū)是細胞轉(zhuǎn)化及pRb降解所必需的，但不直接作用于與pRb的結(jié)合；CR2區(qū)含有與pRb結(jié)合的序列Leu-X-Cys-X-Glu（LxCxE）及2個絲氨酸位點，其可被蛋白激酶Ⅱ（Casein KinaseⅡ，CKⅡ）所磷酸化；在猿病毒40大T抗原（SV40LTAG）、腺病毒的ElA蛋白中也發(fā)現(xiàn)含有CRl區(qū)和CR2區(qū)；CR3區(qū)包含2個C-x-x-C的序列，構(gòu)成一鋅指結(jié)構(gòu)，與pRb及其他宿主細胞蛋白質(zhì)的相互作用以及E7蛋白二聚體的形成有關(guān)［3］。 E7通過位于C末端的鋅指狀結(jié)構(gòu)形成二聚體；N末端的CRl和CR2區(qū)對E7蛋白的體外轉(zhuǎn)化有重要作用。Elizabeth等［4］近期研究發(fā)現(xiàn)，E7擁有其他多瘤病毒小T抗原的部分功能，如類似猿猴病毒40型的功能，可通過剝奪有絲分裂原解除細胞周期G0期阻滯；同時有類似小鼠多瘤病毒的功能，可抑制肌母細胞的分化。

HPV感染過程中首先以低拷貝數(shù)感染基底細胞，然后環(huán)狀DNA開始復制，被感染的基底細胞進入到上皮的增殖區(qū)域，病毒周期進入質(zhì)粒期或游離基因持續(xù)期，此期病毒的基因表達最少，尤其是癌基因E6和E7的表達控制在較低水平。其后，伴隨早期基因E6和E7的大量表達，全部病毒基因的表達均開始明顯升高。El/E2是HPV所編碼的復制酶，除El/E2蛋白外，其復制完全依賴于細胞的復制結(jié)構(gòu)，但HPV復制過程卻發(fā)生在分化并已退出細胞分裂周期的基底上細胞中，這些細胞缺少病毒復制所必需的蛋白等，需要宿主細胞退出分化，重新進入細胞周期，HPVE7起著關(guān)鍵作用［5］。

2 高危型HPV E7蛋白促進宮頸癌變的分子機制

2.1 高危型HPV E7干擾細胞周期促進宮頸癌變的發(fā)生機制 （1）高危型HPV E7結(jié)合并降解pRb蛋白的機制：視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（protein of retionblas-toma，pRb）是一種抑癌蛋白，正常情況下，非磷酸化pRb與核轉(zhuǎn)錄因子E2F特異性結(jié)合，形成二者的復合物后，抑制E2F對靶基因的轉(zhuǎn)錄，使細胞停留在G1期，從而抑制細胞增殖。高危型HPV E7蛋白通過CR2區(qū)的LxCxE結(jié)構(gòu)與pRb第649~672位氨基酸的口袋結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，釋放核轉(zhuǎn)錄因子E2F，誘發(fā)細胞從G1期進入S期，同時E7促使pRb蛋白進入泛素依賴的途徑降解。蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子Cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A（CIP2A）是最近被識別的一種在多種人類惡性腫瘤中過度表達的癌蛋白。Zhang等［6］近期研究表明，HPV16E7蛋白可以通過依賴pRB作用顯著上調(diào)CIP2AmRNA及其蛋白表達。在敲除CIP2A基因的HPVE7陽性宮頸癌細胞中，細胞分裂受到顯著抑制，DNA合成以及G1/S期的細胞周期進展停滯。除了pRb，E7還可以與pRb家族的其他2個成員-p107和p130結(jié)合，同樣競爭與核轉(zhuǎn)錄因子E2F的結(jié)合，使E2F釋放，致使細胞過度增殖、細胞周期調(diào)控失控，導致細胞的永生化，促進宮頸癌的發(fā)生［7］。同時，CR1作用pRb蛋白相關(guān)因子p600，導致細胞的轉(zhuǎn)化并促進細胞增殖。E7還可以通過降低p300相關(guān)因子P/CAF乙?；富钚允筽Rb失活。 （2）高危型HPV E7結(jié)合E2F家族增強E2F介導的轉(zhuǎn)錄的機制：HPV E7蛋白可以直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F1，增強E2F1介導的轉(zhuǎn)錄作用，從而導致細胞不斷增殖。CLaughlin-Drubin等研究認為，HPV E7蛋白能使E2F6的轉(zhuǎn)錄抑制功能失活，從而擾亂關(guān)鍵的細胞保護機制，導致HPV感染細胞的S期感應性增加，加速細胞的S期進程。其研究還認為，E2F6是Polycomb group（PcG）蛋白（PcG蛋白是一組通過染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子）復合物的組分之一，E2F6和PcG蛋白連接，共同抑制轉(zhuǎn)錄［8-9］。而表達E7的細胞E2F6/PcG復合物染色減少，這可能與E7蛋白對E2F6的抑制作用有關(guān)。因此E7蛋白通過E2F家族而影響細胞周期的機制可能是：E7蛋白使經(jīng)典E2F轉(zhuǎn)錄活性增高，細胞為了抵抗這種轉(zhuǎn)錄的增強而大量表達起負反饋作用的E2F6，此時雖然E2F6大量表達，但其活性卻被E7抑制，故細胞最終還是向增殖方向發(fā)展。（3）高危型HPV E7與轉(zhuǎn)錄因子家族的相互作用機制：E7能與核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（Amphipathic Protein 1，AP-1）轉(zhuǎn)錄因子家族作用，AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族包括C-Jun，JunB，C-Fos等，AP-1轉(zhuǎn)錄因子介導早期有絲分裂。有研究發(fā)現(xiàn)，一方面E7鋅指狀結(jié)構(gòu)能與C-Jun的第224~249位氨基酸結(jié)合，激活細胞周期早期進展基因，在E7轉(zhuǎn)化進程中起重要作用。另一方面E7的LxCxE結(jié)構(gòu)能抑制pRb對C-Jun轉(zhuǎn)錄的興奮，使細胞分化脫離細胞周期進展［10］。Neha Jaiswal等［11］近期研究表明，HPV16E7蛋白可通過干擾與結(jié)合酶Ubc9的相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白M1（Forkhead box M1b，F(xiàn)oxM1b）的翻譯后小泛素化修飾，使FoxM1b蛋白的表達上調(diào)而促進轉(zhuǎn)錄。NF-KB是一種多項性多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，其廣泛存在于真核生物中，是一個復雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)許多重要的生理過程，包括急性期炎癥免疫反應、細胞的生長凋亡和腫瘤的形成。而Vandermark等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，E7和E6/E7可抑制HPV16感染的宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)上皮細胞中基礎(chǔ)表達的和TNF-α所誘導的轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活性，從而導致細胞增殖和永生化。這可能與細胞差異性和宿主微環(huán)境有關(guān)。（4）高危型HPV E7與細胞周期相關(guān)蛋白的相互作用：細胞周期相關(guān)蛋白包括三大類：即細胞周期蛋白（cyclins含cyclin A，cyclin D，cyclin E等）、細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs，含CDK2，CDK4，CDK6等）和細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白（cyelin-dependent kinases inhibitory protein，CKI，含P16，P21，P27等）。細胞周期進程由三者進行精密調(diào)節(jié)。HPV感染時，E7蛋白可以與多種細胞周期蛋白相互作用，以多種方式擾亂正常細胞周期，從而促進細胞增殖。Nguyen等［13］研究認為，HPV 16 E7蛋白可以在不依賴pRb，p107或p130的情況下，與cyclin A/CDK2或cyclin E/ CDK2復合物連接，從而增強它們的活性，促進細胞從G1期進入S期或加快S期進程；HPV 6和HPV 11 E7蛋白也可以在pRb/p107/p130缺失的細胞中與CDK2復合物相互作用。此外，純化的HPV 16 E7蛋白可以在體外與cyclin/CDK2相互作用。這些均表明HPV E7可以在缺少其他細胞連接蛋白的情況下直接與cyclin/CDK2復合物相互作用，增強它們促進細胞周期進程的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，E7蛋白亦可抑制p27，p15和p21細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的作用，對G1期構(gòu)成影響，進而使染色體異常復制，產(chǎn)生癌變引起細胞過度增殖［14］。E7能結(jié)合并滅活p21，克服p21介導的對Cyclin E和Cyelin A相關(guān)激酶CDK2的抑制，并能阻滯p21對依賴增殖細胞核抗原（PCNA）DNA復制的抑制作用，從而減弱p21的雙重抑制作用。由于p21也可不依賴pRb來抑制E2F活性，因此導致p21抑制作用的進一步喪失。盡管E7能使細胞免于p53所介導的細胞周期阻滯，但表達E7細胞凋亡水平升高，這可能與DNA復制末期E7直接與CyclinA作用，導致依賴CyclinA的E2F失活過程的失效有關(guān)。2.2 高危型HPV E7抑制宮頸癌細胞MHC-I基因轉(zhuǎn)錄參與免疫逃避的機制 腫瘤細胞必須逃逸機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視才能致病，而腫瘤細胞的免疫逃逸與組織相容性抗原I（MCH-I）分子的表達下調(diào)或缺失有關(guān)。已有研究證實，宮頸癌組織內(nèi)MHC-I表達缺失與其基因各位點的突變、6p21區(qū)域的缺失、雜合缺失和基因轉(zhuǎn)錄異常等相關(guān)［15］。高危型HPV的早期基因E7能抑制MHC-I重鏈基因的啟動子活性，充分表明E7可能通過抑制MHC-I重鏈基因轉(zhuǎn)錄的方式來影響MHC-I的表達。LI等［16］通過ChIP試驗發(fā)現(xiàn)E7特異性結(jié)合在M HC-I啟動子中的-184~-500bp區(qū)域；E7干擾后MHC-I啟動子高乙?；f明了E7通過募集HDAC到MHC-I的啟動子區(qū)導致啟動子組蛋白去乙?；瘡亩种芃HC-I表達。E7能結(jié)合IL-10 及TGF-β啟動子，上調(diào)IL-10 及TGF-β表達，導致抗原介導的生長抑制效應失效，從而導致逃避宿主免疫反應［17］。此外，HPVE7有抑制IFN-γ介導的JAK1/ JAK2/STAT1信號轉(zhuǎn)導通路中信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄激活子1（signal transducer and activator of transcription l，STAT-1）磷酸化的功能，并導致干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor-1，IRF-1）以及抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運子1（transporter associated antigen processing subunit 1，TAP-1）的表達障礙，同時下調(diào)MHC-I類抗原的表達，從而逃避CTL的識別而逃避宿主的免疫監(jiān)管。Jemon等［18］通過建立卵清蛋白抗原（Ova）誘導的模型小鼠發(fā)現(xiàn)，與HPV感染人類皮膚所觀察到的現(xiàn)象一致，HPV16 E7表達的小鼠角質(zhì)細胞中朗格漢斯細胞（LC）數(shù)量表達明顯降低。這表明E7蛋白的獨立作用可導致LC的損耗，并且強烈抑制Ova-特異性的皮膚區(qū)域淋巴結(jié)CD8+T細胞的應答反應 。

2.3 E7與組蛋白去乙?；?、DNA甲基化酶、DNA去甲基化酶的作用 研究表明，E7能與組蛋白去乙?；福℉DAC）、DNA甲基化酶等結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄［19］。組蛋白甲基化酶EZH2是一個致癌因子，在正常細胞中，參與抑癌基因INK4A-ARF的抑制。在一些腫瘤細胞中過表達，可催化組蛋白H3賴氨酸K27位點三甲基化。Daniela等［20］研究表明，E7可促使EZH2的表達，對HPV感染宮頸癌細胞增殖及凋亡抑制具有重要作用。KDM6A是KDM6B的同源蛋白，屬于含Jumonji家族結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶（Jumonji domain-containing histone demethylase，JMJD）家族成員，可通過催化H3K27me3去甲基化，致使細胞周期受阻。Margaret E等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HPV E7的表達通過甲基轉(zhuǎn)移酶KDM6A和KDM6B的轉(zhuǎn)錄誘導導致組蛋白H3上37位的三甲基化賴氨酸H3K27me3標記減少。而HPVE7誘導KDM6B和其轉(zhuǎn)錄靶點p16INK4A的作用獨立于Rb蛋白和E2F的活化作用。這些H3K27me3水平的變化和相關(guān)轉(zhuǎn)錄的改變由于消耗KDM6A和KDM6B抑制宮頸癌細胞的增殖在E7沉默后能迅速扭轉(zhuǎn)，因此可見，E7表達將導致宿主在組蛋白甲基化水平的基因重排，而逐漸致癌。2.4 HPV E7降低基因組穩(wěn)定性和導致DNA損傷的作用 高危型HPV E7蛋白可以導致中心體數(shù)目迅速增多，也可在正常細胞出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定性之前引起中心體數(shù)目的異常，從而干擾有絲分裂。E7表達的細胞，易出現(xiàn)染色體總數(shù)的非整倍性改變等數(shù)目異常，宿主染色體不穩(wěn)定性增加和DNA損傷［21］。E7導致中心體復制錯誤的作用可能與CDK2的功能失調(diào)有關(guān)，CDK2被抑制后不僅可以延緩細胞增殖，亦可降低中心體相關(guān)的有絲分裂缺陷，從而降低宿主基因組穩(wěn)定性。LINE-1基因即長散布重復元件1（long interspersed repeated element-1，LINE-1，L1）反轉(zhuǎn)座子，是人類基因組的重要組成部分。5'UTR為約910 bp的非翻譯區(qū)，其后為兩個開放讀碼框：ORF1和ORF2。Diego E.Montoya-Durango［22］通過瞬態(tài)轉(zhuǎn)錄分析證實，E7單獨或聯(lián)合HDAC2可干擾Rb介導的L1啟動子的轉(zhuǎn)錄，同時，E7可以解除L1MD-A5報告基因的轉(zhuǎn)錄應答而導致基因毒性。

3 討論

2003年美國FAD批準將高危型HPV-DNA檢測用于宮頸病變篩查，2006年首批宮頸癌疫苗上市。但是HPV疫苗的研制、使用、推廣仍面臨許多難題［23］。HPV作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件，已引起大家的重視。對HPV致病機制日益深入的研究將有助于多種預防性疫苗和治療性疫苗的開發(fā)和應用，可逐漸減少宮頸癌對全世界女性健康的威脅，而宮頸癌也將可能成為第一種可以進行預防的惡性腫瘤。而HPV E7作為HPV主要的癌蛋白，其促進宮頸癌變的分子機制極其復雜，尚有待于進一步探究，從而為宮頸疾病的診療提供更多的理論依據(jù)。

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國家自然科學基金（81201541）；上海市浦江人才計劃項目（12PJD002）

201600 上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院

*通信作者