姜黃素對類風濕關節炎患者破骨細胞生成數量和活性的影響

徐子涵，商瑋，趙凌杰，董曉蕾，郭郡浩，劉春麗，常文靜，張蓓蓓，蔡輝,

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.南京軍區南京總醫院中西醫結合科，江蘇 南京 210002)

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姜黃素對類風濕關節炎患者破骨細胞生成數量和活性的影響

徐子涵1，商瑋2，趙凌杰2，董曉蕾2，郭郡浩2，劉春麗2，常文靜2，張蓓蓓2，蔡輝1,2

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.南京軍區南京總醫院中西醫結合科，江蘇 南京 210002)

目的 研究姜黃素對類風濕關節炎(RA)患者破骨細胞生成數量和活性的影響。方法 采集RA患者外周血，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)，經核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)誘導分化，分別采用不同濃度(2.5、5、10 μmol·L-1)姜黃素進行干預；根據姜黃素濃度將實驗分為4組，即空白對照組、姜黃素低濃度組、姜黃素中濃度組和姜黃素高濃度組；14 d后行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測破骨細胞并計數；檢測細胞TRAP活性。結果 細胞培養14 d后，姜黃素低、中、高濃度組的TRAP陽性細胞計數(個/10個視野)分別為96.89±3.51、76.44±1.88和62.56±2.70，均低于空白對照組131.00±4.03(P<0.05)；各濃度組的TRAP活性(U·L-1)分別為5.74±0.36、4.21±0.12和3.06±0.07，均低于空白對照組7.48±0.22(P<0.05)。結論 姜黃素抑制RA患者PBMCs生成破骨細胞的數量和活性，且隨著姜黃素濃度的增加，抑制作用呈增強趨勢。

姜黃素；類風濕關節炎；外周血單個核細胞；破骨細胞

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性進展性滑膜炎癥為特征的自身免疫性疾病。除四肢小關節炎癥外，以骨量丟失為表現的骨代謝異常貫穿于RA的整個病程中，是造成RA患者關節變形，功能減退，高骨折發生率和殘疾的主要原因。破骨細胞主要行使骨吸收功能，主要來源于造血干細胞的單核/巨噬細胞前體。在巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)等細胞因子的作用下，單核細胞前體細胞分化、融合，形成多核破骨細胞，表達抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)和降鈣素受體(calcitonin receptor，CTR)等特異性基因，分泌基質金屬蛋白酶(matrix Metalloproteinases，MMPs)和CatK等蛋白水解酶，從而降解有機骨基質[1]。

姜黃素(curcumin)是從中藥姜黃中提取的一種低分子量的酚類物質。Cho等[2]研究表明，姜黃素具有降低骨吸收強度、改善骨質疏松的作用。這可能與它能降低骨髓基質細胞RANKL的表達，抑制破骨細胞的形成有關[3]。本課題組前期研究發現，姜黃素能增加實驗大鼠骨密度，抑制其骨丟失[4]。為進一步探討姜黃素防治RA骨量丟失的潛在機制，本研究通過體外誘導RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)生成破骨細胞，并觀察姜黃素對破骨細胞生成數量和活性的影響，探討姜黃素對破骨細胞生成的調節機制和作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集2014年7月至2014年12月，南京軍區南京總醫院中西醫結合科門診及住院RA患者15例，其中男性3例，女性12例，平均年齡(46±15)歲，均符合2010年RA的ACR/EULAR分類標準[5]。

1.2 主要試劑 α-MEM培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RANKL、M-CSF(美國Pepro Tech公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，TRAP染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TRAP檢測試劑盒(碧云天生物技術)。

1.3 PBMCs的分離與培養 取RA患者外周血8 mL，用Ficoll密度梯度離心方法分離PBMCs，用PBS清洗2次，用α-MEM培養液配制成濃度為2×106·L-1細胞懸液，接種于24 孔培養板中，每孔800 μL。在37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱內培養。

1.4 分組 共設4組：空白對照組、姜黃素低濃度組、姜黃素中濃度組和姜黃素高濃度組，每組設3個平行樣本。培養2 h后，空白對照組每孔加入800 μL 誘導培養液[RANKL(100 μg·L-1)和M-CSF(50 μg·L-1)]，姜黃素低、中、高濃度組每孔分別加入800 μL含不同濃度(2.5、5、10 μmol·L-1)姜黃素的誘導培養液。放入細胞培養箱培養，隔天換液1次。

1.5 細胞形態學觀察 用倒置顯微鏡觀察培養細胞的形態、細胞融合以及多核細胞形成的情況，并拍照。

1.6 TARP染色并計數 用細胞固定液固定30 s，去離子水沖洗，加入配制好的TRAP 反應液37 ℃恒溫孵育60 min，去離子水沖洗 3 次，干燥，用蘇木精復染3～5 min，堿性液沖洗，晾干。光學顯微鏡(200×)下，隨機選取10個視野，計數TRAP陽性細胞(細胞核≥3 個，胞質呈酒紅色)，取均值，結果用“個/10個視野”表示，每孔重復計數3次。

1.7 TRAP活性測定 用PBS洗3次，用TRIzol液裂解細胞，勻漿，離心取上清。參照按說明書配置相關試劑，設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔，加入試劑及細胞裂解液，混勻后37 ℃孵育10 min，每孔加入160 μL反應終止液，在405 nm測定吸光度。以在pH4.8，37 ℃條件下，每分鐘對硝基苯磷酸二鈉顯色底物產生1 nmol對硝基酚所需的酸性磷酸酶的量定義為一個TRAP活力單位。根據酶活性定義，計算出樣品中的TRAP活性。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察 剛接種后觀察細胞數量較多，體積小，都呈圓形，折光性強，懸浮于培養基中。細胞培養第7天，觀察見培養的細胞中有個別細胞體積增大，輪廓清晰，呈橢圓形或不規則形，并有細長的偽足，細胞核體積增大，呈圓形或橢圓形。第14天，可見多個多核細胞，胞體明顯增大，折光性強，形態有油煎蛋形、漏斗形或不規則形，有裙狀或絲狀偽足，胞內有3～5個以上的細胞核，胞漿中有較多空泡，符合破骨細胞的形態特征(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(200×)

2.2 TRAP染色陽性細胞計數結果 如圖2所示，結果顯示，空白對照組TRAP陽性細胞數較多，體積較大，染色較深。相比而言，姜黃素低、中、高各濃度組中形成的TRAP陽性細胞數較少，體積較小，染色較淡。細胞計數結果顯示：姜黃素低、中、高濃度組破骨細胞數量均較空白對照組少，且差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

注：A.空白對照組；B.姜黃素低濃度組；C.姜黃素中濃度組；D.姜黃素高濃度組

圖2 TRAP染色(200×)

2.3 TRAP活性測定結果 如表1所示，姜黃素低、中、高濃度組的TRAP活性均低于與空白對照組，且差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組TRAP陽性細胞計數、TRAP活性比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05。

3 討論

RA是臨床上常見的結締組織病，以滑膜炎、滑膜增生及血管翳形成為基本特征[6]，此外，骨量丟失也是RA常見的病理改變，包括關節周圍骨量減少、骨侵蝕和廣泛性骨質疏松。在人體內，骨骼不間斷地重復著清除陳舊骨及形成新骨的骨重建過程，在正常生理條件下，破骨細胞和成骨細胞相互偶聯與調節，以維持骨代謝平衡[7]。目前研究認為破骨細胞數量增加，活性增強，以骨吸收增加為主的骨代謝失衡是RA骨量丟失的主要原因[8]。

破骨細胞是人體內唯一具有骨破壞能力的細胞，它來源于單核巨噬細胞系的多核終末分化細胞。這些細胞具有向骨吸收區移動的特性，可黏附于骨表面分化為單核的破骨細胞前體細胞，并進一步互相融合成為多核巨細胞，分泌CatK、MMP-9 和TRAP5等蛋白水解酶進入骨吸收陷窩，并通過質子泵分泌H+，降解骨基質。

破骨細胞具有不能傳代、存活時間短等特點，且破骨細胞在體內數量極少，難以分離獲得[9]。破骨細胞的培養方法主要有分離法和誘導法。Fujikawa等[10]首次應用人外周血分離的單核細胞誘導培養出破骨細胞，該培養法具有來源豐富、取材方便等優點。進一步研究發現，在培養過程中為促進前體細胞向破骨細胞分化，必須使用兩種誘導劑，分別是RANKL和M-CSF，兩者缺一不可，共同發揮誘導作用[11]。本實驗為體外培養RA患者的破骨細胞，選用PBMC誘導法，通過加用RANKL和M-CSF兩種誘導劑，誘導前體細胞向破骨細胞分化。

破骨細胞的鑒定主要從細胞形態、TRAP 染色、TRAP活性檢測等方面進行。誘導成熟的破骨細胞呈圓形或不規則形，胞體較大，胞核為3～15 個，邊界不整見偽足。TRAP是酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)同工酶的第5型，為破骨細胞所特有，直接參與破骨細胞的骨吸收過程。TRAP染色是鑒定破骨細胞的常用方法，通常將TRAP染色陽性、胞核≥3個的細胞認定為破骨細胞，通過TRAP染色陽性細胞計數，可以評估誘導生成的破骨細胞的數量。TRAP活性水平被認為是反映破骨細胞功能以及臨床判斷骨吸收的敏感而特異性指標。因此，可以通過這幾個方面來觀察破骨細胞的數量和分泌活性。

姜黃(curcumalongaL)為姜科草本植物姜黃的干燥根莖，其味辛、苦，性溫，入肝脾二經，具有行氣、散風活血、通經止痛之功效。姜黃素是從姜黃中提取的一種低分子量的酚類物質，現有研究證實它具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑制血管新生、抗動脈粥樣硬化和神經保護等藥理作用，與其能影響NF-κB等轉錄因子，TNF-α、IL-1等細胞因子的表達有關[12]。Hussan等[13]研究發現，姜黃素能減少破骨細胞數量，同時增加成骨細胞數量，從而對卵巢切除后大鼠骨丟失有一定治療作用。

本研究采用RA患者PBMCs誘導培養破骨細胞，并在培養過程中用低、中、高濃度的姜黃素進行干預，通過觀察細胞形態學特征、TRAP染色和計數觀察姜黃素對破骨細胞生成數量的影響，檢測細胞TRAP活性觀察姜黃素對破骨細胞分泌活性的影響。結果顯示，與空白對照組相比，姜黃素各濃度組均能減少RA患者PBMCs生成破骨細胞的數量，抑制破骨細胞分泌的TRAP活性，且隨著姜黃素濃度的增加，抑制作用更明顯。因此，我們認為姜黃素具有抑制RA患者破骨細胞生成數量和活性的作用，為臨床應用姜黃素防治RA骨破壞提供了實驗依據。

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Effects of curcumin on the number and activity of osteoclasts in patients with rheumatoid arthritis

XU Zihan1，SHANG Wei2，ZHAO Lingjie2，et al

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing，Jiangsu210023，China；2.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，PLA，Nanjing，Jiangsu210002，China)

Objective To investigate the effects of curcumin on the osteoclastogenesis from rheumatoid arthritis(RA)patients in vitro.Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)from patients with RA separated by density centrifugation were cultured in the medium containing M-CSF and RANKL,added with different concentrations of curcumin in the process.There were 4 groups named blank control group,curcumin 2.5 μmol·L-1group,curcumin 5 μmol·L-1group and curcumin 10 μmol·L-1group.After cultured for 14 days,TRAP staining was used for the detection and calculation of osteoclasts and the activity of TRAP was evaluated.Results After cultured for 14 days,the number of TRAP-positive osteoclasts were decreased significantly in curcumin 2.5 μmol·L-1group(96.89±3.51),curcumin 5 μmol·L-1group(76.44±1.88),curcumin 10 μmol·L-1group(62.56±2.70),which were significantly lower than that in the blank control group(131.00±4.03,P<0.05).The activities of TRAP in 2.5 μmol·L-1group,5 μmol·L-1group and 10 μmol·L-1group were 5.74±0.36 U·L-1,4.21±0.12 U·L-1and 3.06±0.07 U·L-1,which were lower than that in the blank control group(7.48±0.22 U·L-1,P<0.05).Conclusions Curcumin can inhibit the osteoclastogenesis of the PBMCs from RA patients,and the inhibition effect is enhanced with the increase in the concentration of curcumin.

Curcumin;Rheumatoid arthritis;Peripheral blood mononuclear cell;Osteoclast

南京軍區南京總醫院科研基金(2015039)

蔡輝，男，教授，博士生導師，研究方向：中西醫結合臨床與基礎研究，E-mail：njzy_caihui@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.043

2016-04-14，

2016-07-20)