金沙牛化石片高效液相色譜指紋圖譜研究

劉仔，蓬展鵬，鄺惠珍，董明國(guó)

(東莞市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 523000)

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金沙牛化石片高效液相色譜指紋圖譜研究

劉仔，蓬展鵬，鄺惠珍，董明國(guó)

(東莞市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 523000)

目的 建立金沙牛化石片高效液相色譜(HPLC)法指紋圖譜，為科學(xué)評(píng)價(jià)金沙牛化石片質(zhì)量及其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性提供依據(jù)。方法 采用AgiLent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，以0.2%磷酸-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25 ℃。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)10批金沙牛化石片進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果 以夏佛塔苷為參照峰，初步建立了金沙牛化石片HPLC指紋圖譜，確定了18個(gè)共有峰，10批金沙牛化石片樣品指紋圖譜相似度均在0.9以上。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于金沙牛化石片質(zhì)量控制。

金沙牛化石片；高效液相色譜；指紋圖譜

金沙牛化石片，批準(zhǔn)文號(hào)：粵藥制字Z20070471，是由金沙牛、廣金錢(qián)草、穿山甲、雞內(nèi)金、滑石、川牛膝、海金沙、冬葵果、皂角刺、桃仁、三七、石韋多種中藥材提取加工制成，根據(jù)我院老中醫(yī)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所得，應(yīng)用于治療泌尿結(jié)石、尿路感染等癥狀療效顯著[1-2]。課題組前期研究表明[3]，該藥具有增加尿量、增加尿液中枸櫞酸、減少尿酸及減輕尿路感染炎性反應(yīng)而發(fā)揮防治泌尿系結(jié)石的作用。

目前，關(guān)于金沙牛化石片質(zhì)量控制方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，難以客觀反映該藥的整體質(zhì)量狀況以及各生產(chǎn)批次的優(yōu)劣情況。而中藥指紋圖譜技術(shù)具有系統(tǒng)性、整體性和穩(wěn)定性等特點(diǎn)，可較好地反映含有復(fù)雜成分的中藥制劑其內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，是解決金沙牛化石片生產(chǎn)質(zhì)量問(wèn)題的有效手段[4-8]。因此，本文建立了金沙牛化石片指紋圖譜的分析方法，對(duì)不同生產(chǎn)批次的金沙牛化石片進(jìn)行研究并得出其對(duì)照指紋圖譜，以期為該片劑的質(zhì)量控制以及生產(chǎn)加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AgiLent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司，DAD檢測(cè)器，二元梯度泵)，軟件為chemstation色譜工作站；AgiLent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；SHIMADZU AUW120D電子天平(日本島津公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)。

1.2 試藥 夏佛塔苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111912-201302，含量92.5%)；金沙牛化石片(每素片重0.25 g，東莞市中醫(yī)院醫(yī)院制劑)。

甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)默克公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流速1.0 mL·min-1；以乙腈為流動(dòng)相 A，0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸的水溶液為流動(dòng)相B，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣體積20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取夏佛塔苷對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為91.58 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL至10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得45.79 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

2.3 金沙牛化石片供試品溶液制備 取金沙牛化石片50片，去除糖衣后，混勻，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中,加入 80%甲醇50 mL，稱定重量，水浴回流提取1 h，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批金沙牛化石片(批號(hào):20140804)，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以夏佛塔苷峰為參照，其保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批金沙牛化石片(批號(hào):20140804)，分別于制備后0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以夏佛塔苷峰為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金沙牛化石片(批號(hào):20140804)，分別精密稱取6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以夏佛塔苷峰為參照，其保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 金沙牛化石片HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到S1～S10供試品的HPLC指紋圖譜，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，確定共有峰，并選取18個(gè)共有峰作為特征指紋峰。以峰面積較大且穩(wěn)定，分離度好，出峰時(shí)間適中的13號(hào)峰作為參照峰，經(jīng)與夏佛塔苷對(duì)照品的出峰時(shí)間及紫外圖譜比對(duì)，確認(rèn)13號(hào)峰為夏佛塔苷(廣金錢(qián)草中有效成分)，見(jiàn)圖1。以13號(hào)夏佛塔苷色譜峰為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積值。

圖1 金沙牛化石片HPLC圖

2.5.2 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)10批金沙牛化石片HPLC圖譜進(jìn)行處理，匹配結(jié)果見(jiàn)圖2，所生成的對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖3。10批金沙牛化石片與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為：0.921，0.983，0.955，0.983，0.931，0.950，0.981，0.977，0.970，0.968。

圖2 10批金沙牛化石片

圖3 對(duì)照指紋圖譜匹配色譜圖

各批金沙牛化石片與對(duì)照指紋圖譜的相似度均較高，為了保證金沙牛化石片的質(zhì)量，建議規(guī)定按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)計(jì)算，供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度不得低于0.9。

3 討論

3.1 供試品溶液的制備 金沙牛化石片的制劑工藝中，除金沙牛、穿山甲、三七為細(xì)粉入藥，其余九味藥材均為水提取物入藥。考慮到水提取物極性較大，本試驗(yàn)選用了水、80%甲醇、甲醇作為溶媒比較提取效果，同時(shí)考察了超聲和水浴回流提取方式及提取時(shí)間的影響，結(jié)果以80%甲醇水浴回流提取1 h時(shí)指紋峰信息較為豐富且干擾較少。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 比較254、272、300、330 nm波長(zhǎng)時(shí)的色譜峰數(shù)目、響應(yīng)強(qiáng)度、各峰之間的分離度，最終選用254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 比較了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸4種洗脫體系，結(jié)果用乙腈-0.2%磷酸體系洗脫時(shí)，大多數(shù)峰的對(duì)稱性較好、理論塔板數(shù)較高，各峰之間的分離度較好，并且基線最為平穩(wěn)，因此最終選擇乙腈-0.2%磷酸作為流動(dòng)相。

3.4 色譜柱篩選 嘗試了KromosiL C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Thermo HypersiL ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)及AgiLent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，分離情況無(wú)明顯差異，但使用ZORBAX SB-C18柱時(shí)峰形較好，且該色譜柱耐酸性較強(qiáng)，最終選用ZORBAX SB-C18色譜柱。

3.5 指紋圖譜分析 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立了金沙牛化石片指紋圖譜分析方法，以13號(hào)夏佛塔苷峰為參照峰確認(rèn)了金沙牛化石片18個(gè)共有峰，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)軟件生成了10批金沙牛化石片的對(duì)照指紋圖譜，并計(jì)算出各批樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度。相比于單個(gè)主成分含量測(cè)定而言，指紋圖譜能從整體層面綜合反映中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量，該方法可為金沙牛化石片的質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制提供依據(jù)，有助于課題組后續(xù)開(kāi)展譜效關(guān)系研究。

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[3] 莫琰，張繼峰，盧廣明，等.金沙牛化石片對(duì)泌尿系結(jié)石尿液中成石因素影響的臨床研究[J].河北中醫(yī)，2011,33(12):1774．

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HPLC fingerprint of jinshaniu huashi tablets

LIU Zai，PENG Zhanpeng，KUANG Huizhen，et al

(PharmaceuticalDepartment,DongguanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Dongguan,Guangdong523000,China)

Objective To establish HPLC fingerprints of jinshaniu huashi tablets,to provide basis for the scientific assessments of jinshaniu huashi tablets’ quality and stability of the production process.Methods The separation was performed on a ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)with 0.2% phosphoric acid-acetonitrile as the mobile phase in a gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 254 nm,and the column temperature was set at 25 ℃.Fingerprint Similarity Evaluation Software(edition 2012)of Chinese Pharmacopoeia Commission was used to evaluate the similarity of the 10 batches of Jinshaniu Huashi Tablets.Results The common mode for the HPLC fingerprint was set up with schaftoside as the reference peak.Eighteen co-processing peaks were selected as the fingerprint peaks of jinshaniu huashi tablets.Good similarities with correlation coefficients higher than 0.9 were found between 10 batches of jinshaniu huashi tablets and the standard fingerpint.Conclusions The method is simple,accurate,and reproducible,which could be used for quality control of jinshaniu huashi tablets.

Jinshaniu huashi tablets;HPLC;Fingerprint

廣東省東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2003)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.010

2016-06-24，

2016-08-11)