乳腺癌細(xì)胞中化療藥物對(duì)Ser10磷酸化p27kip1表達(dá)的影響

呂青山，郭志琴，鄔萬新

乳腺癌細(xì)胞中化療藥物對(duì)Ser10磷酸化p27kip1表達(dá)的影響

呂青山，郭志琴，鄔萬新

目的探討腫瘤化療藥物對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中第10位絲氨酸（Ser10）磷酸化的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27kip1（P-p27Ser10）表達(dá)的影響。方法分別用化療藥物多西他賽（DOC）、表柔比星（EPI）及兩者聯(lián)合處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，運(yùn)用MTT比色法測定化療藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力的影響；采用Western Blot檢測化療藥物處理前后P-p27Ser10、Jab1和p27kip1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果化療藥物DOC、EPI及兩者聯(lián)合處理對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖均有抑制作用，且隨化療藥物濃度的增加抑制率增強(qiáng)，兩藥聯(lián)合處理有更強(qiáng)的抑制作用。化療藥物處理后，P-p27Ser10和Jab1蛋白表達(dá)增加，p27kip1蛋白表達(dá)降低，與單一用藥相比，聯(lián)合處理組蛋白表達(dá)改變更為明顯。結(jié)論腫瘤化療藥物可能是部分通過p27kip1Ser10的磷酸化變化引起p27kip1及相關(guān)分子Jab1的改變，從而介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的周期調(diào)控。p27kip1Ser10磷酸化調(diào)節(jié)作用可能成為治療乳腺癌的新途徑?！娟P(guān)鍵詞】乳腺腫瘤；p27kip1；磷酸化；化療敏感性

乳腺癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤。近年來，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已位居女性癌癥病死率的首位[1]?；熓侨橄侔┚C合治療的重要手段之一，可明顯提高患者的生存率，但乳腺癌細(xì)胞存在多藥耐藥現(xiàn)象，研究乳腺癌細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生的具體機(jī)制是目前急需解決的難題。研究表明，p27kip1是一種重要的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白，可作為潛在的化療敏感性的預(yù)測指標(biāo)[2-3]。磷酸化是調(diào)節(jié)p27kip1蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位的重要機(jī)制[4]。據(jù)報(bào)道，在p27kip1出核降解前必須經(jīng)歷第10位絲氨酸（Ser10）的磷酸化，而Ser10磷酸化的p27kip1（P-p27Ser10）可以與c-Jun激活區(qū)結(jié)合蛋白1（Jab1）特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)p27kip1出核轉(zhuǎn)運(yùn)，參與細(xì)胞周期調(diào)控[5]。因此，本研究通過檢測乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中P-p27Ser10和相關(guān)蛋白Jab1在臨床常用化療藥物處理前后的表達(dá)改變，分析化療藥物對(duì)其表達(dá)的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化乳腺癌化療方案提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料人類乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑兔抗人p27kip1多克隆抗體（C-19，美國Santa Cruz公司）；兔抗人P-p27Ser10多克隆抗體（34-6300，美國Zymed公司）；小鼠抗人Jab1單克隆抗體（611618，美國BD公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG、抗小鼠IgG和-肌動(dòng)蛋白（-actin）單克隆抗體（美國Sigma公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（美國Pierce公司）。含青霉素100 U/ml、鏈霉素100g/ml、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），MTT試劑盒（美國Sigma公司）。

1.3 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d后，用2.5 mg/ml胰酶消化，細(xì)胞傳代一次。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4 化療藥物配制實(shí)驗(yàn)選用藥物為多西他賽（docetaxel，DOC，江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）和表柔比星（epirubicin，EPI，浙江海正藥業(yè)股份有限公司）。所用藥物的100%測試藥物濃度（TDC）為按國家藥物常規(guī)用量在藥代動(dòng)力學(xué)的指導(dǎo)下測出的血漿內(nèi)峰濃度（PPC）[6]。實(shí)驗(yàn)藥物濃度分別為0.2、1和5×PPC濃度，聯(lián)合用藥組濃度與單一用藥組濃度一致。上述藥物用0.9%氯化鈉注射液稀釋成工作液。

1.5 MTT操作步驟實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分：DOC單藥處理組、EPI單藥處理組和兩藥聯(lián)合處理組。空白組：無細(xì)胞培養(yǎng)液90 l加10 l 0.9%氯化鈉注射液；對(duì)照組：細(xì)胞懸液90 l加10 l0.9%氯化鈉注射液；單藥處理組：細(xì)胞懸液90 l加10 l化療藥；兩藥聯(lián)合處理組：細(xì)胞懸液90 l加各5 l化療藥。每組復(fù)種5孔。置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，加MTT（5mg/ml）稀釋液，20 l/孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入10%十二烷基硫酸鈉100 l/孔，溶解甲膳，終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度（OD）值（測量波長570 nm，參考波長630 nm），取每組5孔OD的平均值作最后結(jié)果。按下述公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：抑制率（IR）＝（OD

1.6 Western Blot檢測根據(jù)試劑說明書，用細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞總蛋白，并用bradford法檢測所提取蛋白的濃度；取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；室溫封閉2 h；加一抗（p27kip1，1︰800；P-p27Ser10，1︰1 000；Jab1，1︰600；-actin，1︰2 000），室溫孵育1 h，4℃冰箱過夜；HRP耦聯(lián)的二抗（1︰1000）室溫孵育2h；ECL顯色。Bio-Rad Quantity分析軟件測定區(qū)帶的OD，-actin作內(nèi)參對(duì)照，用目的片段與-actin的OD比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化療藥物DOC和EPI對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響MTT法分析結(jié)果顯示，DOC和EPI分別以0.2、1和5倍PPC濃度作用MDA-MB-231細(xì)胞48h后，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制率也增加，呈明顯的劑量依賴性。與單一用藥相比，兩藥聯(lián)合處理抑制作用更強(qiáng)。在1倍PPC濃度下，對(duì)細(xì)胞的抑制作用最為明顯。見表1。

2.2 乳腺癌細(xì)胞中P-p27Ser10、Jab1和p27kip1蛋白表達(dá)Western Blot檢測結(jié)果顯示，化療藥物處理后，P-p27Ser10和Jab1蛋白表達(dá)均明顯增高，且兩藥聯(lián)合處理組增加最為明顯，而p27kip1蛋白在化療藥物處理后表達(dá)降低。見封二彩圖4。

表1 MTT法檢測DOC和EPI對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力影響

3 討論

乳腺癌輔助化療是乳腺癌整體治療方案的重要組成部分?；熞环矫婵梢员Ａ羧榉?，提高患者的生存質(zhì)量，另一方面可以延長患者的生存時(shí)間，提高生存率。然而，化療面臨的最大問題就是化療耐藥和對(duì)人體的毒副作用，這不僅降低化療效果，而且加速疾病的進(jìn)展。大多數(shù)化療藥物是針對(duì)細(xì)胞周期的某個(gè)環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)的，它們通過破壞細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，從而促進(jìn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，如果細(xì)胞周期發(fā)生改變，則可能引起腫瘤細(xì)胞的化療耐藥。因此，研究細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤化療藥物敏感性的關(guān)系可為探索腫瘤化療耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，進(jìn)而尋找干預(yù)手段提供有意義的線索。

p27kip1作為一種重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其蛋白表達(dá)和活性改變與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[7-8]。Brown等[9]研究發(fā)現(xiàn)，p27kip1低表達(dá)可能參與介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的耐藥性。但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中p27kip1高表達(dá)，使癌細(xì)胞增殖率降低，對(duì)環(huán)磷酰胺不敏感，而下調(diào)其表達(dá)，敏感性逐漸恢復(fù)[10]。上述p27kip1蛋白對(duì)化療敏感性預(yù)測的不一致，可能是由于這些研究只檢測該分子蛋白表達(dá)，而沒有考慮磷酸化對(duì)其功能活性的影響。p27kip1分子內(nèi)存在數(shù)十個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，其中，Ser10是主要的磷酸化位點(diǎn)，占p27kip1蛋白總磷酸化水平的70%以上[11]。研究顯示，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期，Ser10發(fā)生磷酸化，在出核相關(guān)分子Jab1等的作用下，Ser10磷酸化的p27kip1出核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，從亞細(xì)胞定位角度調(diào)節(jié)p27kip1蛋白的功能[12]。因此，研究Ser10磷酸化水平與化療藥物敏感性的關(guān)系具有十分重要的意義。

體外藥敏試驗(yàn)是臨床腫瘤治療中常用且相當(dāng)重要的方法，開展腫瘤藥敏試驗(yàn)并以藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床腫瘤化療有著重要意義。MTT比色法以簡便、快捷、可評(píng)率高及觀察終點(diǎn)客觀等優(yōu)點(diǎn)用于多種腫瘤的體外藥敏試驗(yàn)中。MDAMB-231是一種三陰性（即雌激素受體、孕激素受體和表皮生長因子受體2均為陰性）乳腺癌細(xì)胞株，具有高侵襲性，高轉(zhuǎn)移性和惡性度高的特性。因此，本研究利用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞模擬乳腺癌患者的體內(nèi)環(huán)境，采用MTT比色法測定化療藥物對(duì)其細(xì)胞活力的影響，分析p27kip1Ser10磷酸化與化療藥物敏感性的關(guān)系。MTT結(jié)果顯示，臨床常用化療藥物DOC和EPI對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制率增強(qiáng)，且兩藥聯(lián)合處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，這證實(shí)了蒽環(huán)類和紫杉類化療藥物仍是目前臨床治療乳腺癌的有效藥物的觀點(diǎn)，且聯(lián)合用藥方案更為有效，但具體哪類藥物更有效還未知。上述這些結(jié)果提示，p27kip1Ser10磷酸化及相關(guān)分子Jab1蛋白表達(dá)增加，可使細(xì)胞核內(nèi)的p27kip1出核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，調(diào)節(jié)p27kip1核內(nèi)外分布，降低p27kip1在細(xì)胞核中的表達(dá)水平，這一過程可能在乳腺癌化療藥物敏感性中發(fā)揮重要作用。當(dāng)然，乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，僅利用單一的乳腺癌細(xì)胞株來進(jìn)行研究，存在一定的局限性，應(yīng)進(jìn)一步從不同分子表型的乳腺癌新鮮組織標(biāo)本著手，探討p27kip1Ser10磷酸化對(duì)乳腺癌化療敏感性的影響。

綜上所述，乳腺癌化療藥物改變p27kip1Ser10磷酸化及Jab1蛋白表達(dá)水平，參與細(xì)胞周期調(diào)控，從而抑制腫瘤生長。但是化療藥物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的具體機(jī)制還要進(jìn)一步證實(shí)。本研究為進(jìn)一步從分子水平研究p27kip1磷酸化與乳腺癌化療藥物敏感性關(guān)系打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。今后將進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究和機(jī)制探討，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.12.028

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1671-0800(2016)12-1597-03

2016-04-10

（本文編輯：陳志翔）

浙江省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃（GJJX-010-001）；嘉興市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)支撐學(xué)科建設(shè)計(jì)劃（04-Z-01）；浙江省嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013AY21042-3）

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