褪黑素對異丙腎上腺素致小鼠急性心肌缺血的保護作用

羅馨怡 劉川寧 邱有波 楊 拯

(成都醫學院實驗技術教研室,四川 成都 610081)

目前已有研究證實，缺血缺氧性心肌損傷與細胞炎癥反應、細胞凋亡有關〔1〕，并且存在嚴重的自由基損害效應。褪黑素(MT)是近年發現的松果腺分泌的神經內分泌激素，是一種高效的抗氧化劑和自由基清除劑。它可以清除過氧化氫等自由基，以此來減少氧化應激，還可以通過抑制細胞內鈣的增加和興奮肌漿內鈣的活動性來減少細胞內的游離鈣離子堆積，使心肌免受局部缺血的損害。有實驗研究表明，MT有調節血脂代謝〔2〕和抗缺血再灌注心律失?！?〕等作用，但對心肌缺血的作用在國內還未見報道。本研究旨在探討MT對小鼠急性心肌缺血的保護作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康昆明種小鼠100只，雌雄各半，體重(24±2)g，四川大學實驗動物中心提供，合格證編號 〔SCXK(川)-10-2006〕。鹽酸異丙腎上腺素(Iso)：上海禾豐制藥有限公司；MT：深圳市生命力科技發展有限公司；戊巴比妥鈉(德國進口分裝)：北京化學試劑公司；鈉石灰：上海陸都化學劑廠出品。BL-420E+生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)；101-2A型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組與給藥 將健康、體重均勻的小鼠100只隨機分為正常對照組、模型組、MT低、中、高劑量組，每組20只，其中隨機抽取10只用于心電監測及心肌含水量(MWC)和心肌指數(AI)的測定，另外10只用于耐缺氧實驗，均禁食12 h后預防給藥。正常對照組和模型組給予生理鹽水10 ml/kg；MT組將MT用生理鹽水配制成低劑量(5 mg/kg)、中劑量(10 mg/kg)、高劑量(20 mg/kg)不同濃度的懸濁液，灌胃30 min后，腹腔注射Iso造模。

1.2.2動物模型制備 各組小鼠灌胃30 min后，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將小鼠四肢固定，除正常對照組給予等量生理鹽水外，其余4組一次性腹腔注射Iso 2 mg/kg。

1.2.3心電圖S-T段偏移值測量 將各組小鼠固定后，于四肢皮下插入針形電極，連接BL-420E+系統，記錄標準肢體Ⅱ導聯心電圖，在健康小鼠中依次描記造模后1、5、10、15、20、25、30 min Ⅱ導聯心電圖，測量S-T段偏移值。其偏移值的測定是比較QRS波的終末部分與S-T段起始段的交接點(即J點)與基線的偏移程度，無論升高或者是降低，取其絕對值。

1.2.4MWC及AI的測定 小鼠心電圖監測完畢后，迅速取出完整心肌組織，剔除表面大血管及多余結締組織，在生理鹽水中浸洗，除去血液，用濾紙試干，稱其心肌濕重，再用電熱鼓風干燥箱于110 ℃干烤8 h后，稱其干重。計算MWC及MI。

1.2.5常壓耐缺氧試驗 各組10只小鼠分別取按照給藥劑量腹腔注射預防給藥(同上)，給藥30 min后，小鼠腹腔注射鹽酸Iso 2 mg/kg(正常對照組注射等容積生理鹽水)造模。15 min后將小鼠放入容積為250 ml的密閉廣口瓶中，瓶蓋周圍涂凡士林，保證密封完全，以免空氣進入。瓶內放有25 g鈉石灰，以呼吸停止為指標，觀察并記錄小鼠存活時間。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1MT對急性心肌缺血小鼠心電圖S-T段的影響 在腹腔注射Iso 1 min開始，模型組組與正常對照組比較，各時間點S-T段偏移值均抬高(P<0.01)。MT低、中、高劑量組，S-T段偏移值與模型組差異均具有顯著性(P<0.01)。說明模型組給予Iso能引起S-T段的偏移(抬高或降低)，出現心肌缺血性的典型心電圖改變，而MT各劑量組可以在一定程度上減輕S-T段的偏移，表明MT可以適當降低Iso對心肌的損傷。但是MT各組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠Iso 30 min內心電圖ST段變化比較±s，n=10)

2.2MT對急性心肌缺血小鼠MI的影響 小鼠MI抑制率，模型組的值明顯高于正常對照組(P<0.01)。MT低、中、高劑量組MI抑制率均低于模型組(P<0.05)。而不同劑量組之間無統計學意義(P>0.05)，對劑量不成依賴性。見表2。

表2 MT對Iso誘發小鼠急性心肌缺血小鼠存活時間、MWC、MI的影響±s，n=10)

2.3MT對急性心肌缺血小鼠小鼠MWC的影響 模型組及不同劑量用藥組的MWC均較正常對照組高，其中模型組最高，與正常對照組比較差異有顯著性(P<0.01)。MT組MWC均有下降(P<0.05)，但高、中、低三個劑量之間無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4MT對急性心肌缺血小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響 小鼠心肌缺血后，在常壓缺氧情況下，模型組小鼠的生存時間最短，與正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)，提示造模成功。與模型組比較，MT各劑量組小鼠的存活時間均延長，MT高、中、低三個劑量之間比較無顯著差異(P>0.05)，提示對劑量無明顯依賴性。見表2。

3 討 論

Iso是心肌收縮力和代謝的重要調節器，異丙腎上腺素同時作用于β1和β2受體，增強了收縮力，引起了心臟壁的不均勻收縮〔4〕，導致心肌的過度活動和冠狀低血壓。正常機體氧自由基和抗氧自由基系統處于一種動態的平衡，而研究表明，Iso能使心肌產生細胞毒性自由基，將這種平衡打破，導致超氧負離子和過氧化氫等氧化產物的生成，對心臟產生嚴重的自由基損傷效應〔5〕，并且可誘導心肌細胞的凋亡〔6〕。這是Iso導致心肌損傷的主要機制，此外，過量的兒茶酚胺能夠引起細胞的顯著損害，例如心肌缺氧，急性的冠狀缺血和心內膜下梗死。它所引起的膜脂質過氧化、血漿高凝狀態形成血管內皮受損和微血栓〔7〕。有學者認為此種類型的心肌缺血是由于炎癥應答〔8，9〕和鈣離子堆積引起的。由于在心內膜和心肌中層發現了大量炎癥細胞的局灶性壞死〔10〕，這在形態學上與人類缺血性心臟病相似，可作為評價藥物對心肌缺血作用的動物模型〔11〕。

有研究發現，MT作為抗氧化劑起著清除自由基、保護機體免受氧化損傷的作用。體內的自由基主要來源于酶促反應與非酶促反應，使細胞功能不能正常發揮，甚至加速其凋亡。而MT清除自由基以防止損傷，可以從多個環節進行：如直接清除自由基，抑制脂質過氧化反應等。其機制為MT與自由基結合，防止自由基氧化的反應，也可以與自由基的受體結合，引起細胞內特異性酶的改變。同時，MT除了直接清除自由基以抗氧化反應外，還能增強抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化酶的活性，也能保護自由基損傷〔12〕。此外，MT的高親脂性和親水性，使其以易于通過生理屏障到達組織內的細胞，并穿透細胞膜，進入細胞核，使得細胞內部也收到保護。研究還證實，高濃度的自由基能能降低心肌細胞Ca2+所依賴的三磷酸腺苷，而MT可以改變細胞內的氧化狀態，提高心肌細胞Ca2+泵的活性。與此同時調整細胞內鈣的水平，防治鈣超載，抑制交感神經，減少心肌細胞上得腎上腺素能受體。

本研究采用腹腔注射一次性注射大劑量Iso，造成急性心肌缺血模型。模型造成后，觀察各項指標，其中，心電圖是最早顯示是否產生心肌損傷的指標，特別是S-T段的改變為一種簡單有效的辦法，可作為測量心肌缺血最重要的指標〔13〕，它的偏移值反映了缺血區和非缺血區的電位差〔14〕，MT的預防處理明顯降低了S-T段的偏移值，因此，MT對細胞膜有保護效應，其機制可能是維持了還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽抗氧化酶的水平，從而保護了細胞膜的完整性〔15〕。

AI和MWC也是觀察心肌缺血一個很重要的指標，目前認為，這些指數的升高是由于心肌水容量和蛋白質的增加，除此之外，心肌內的水腫，也是AI增加的一個重要原因，在水腫的心肌細胞內，可以發現黏多糖的堆積和細胞滲入，心肌水容量的增加將直接導致心肌功能的減退〔16〕。實驗結果表明，MT能夠明顯降低AI及MWC，可能的機制為MT能減少心肌的水容量和蛋白質，緩解心肌水腫，在一定程度上恢復心功能。此外，除了在缺血狀態下MT對心肌有保護作用，在缺氧時，MT也同樣有對抗作用。小鼠在常壓缺氧的狀態下存活可以反映一定的對缺氧環境的耐受能力，如果在常壓缺氧狀態下注射異丙腎上腺素，會明顯地增加心肌的耗氧量，使心肌急性缺氧，導致小鼠的存活時間縮短。說明MT能改善心肌缺氧的供求矛盾，其作用機制復雜，可能是通過清除自由基，抑制炎癥應答反應，提高組織對缺血的耐受性等抑制心肌缺血損傷。也可能是改善微循環，減輕動脈的收縮力，擴張冠狀動脈，增加血流量，減慢心率，降低心肌耗氧指數，進一步改善缺血心肌的代謝，以此來增強耐缺氧的能力。

綜上，本研究結果顯示MT通過保護細胞膜完整性、緩解心肌水腫、增強耐缺氧能力、清除自由基等途徑來保護缺血缺氧性心肌損傷，使S-T段偏移、AI明顯降低，耐氧存活時間延長，但高、中、低劑量之間無顯著差異，有待進一步研究。除外上述指標所反映的MT保護缺血缺氧性心肌損傷的保護機制外，褪黑素還可以抑制誘導一氧化氮合酶〔17，18〕、減少誘導產物的生成，以保護線粒體呼吸鏈功能〔19〕等，需要進一步探究。

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