復(fù)方益智顆粒對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究

郝二偉 鄧家剛 杜正彩 侯小濤 繆劍華

(1 暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程博士后流動(dòng)站，廣州，510632； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中藥效篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧，530001； 3 廣西藥用植物園，南寧，530000)

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復(fù)方益智顆粒對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究

郝二偉1，2，3鄧家剛2杜正彩2侯小濤2繆劍華3

(1 暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程博士后流動(dòng)站，廣州，510632； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中藥效篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧，530001； 3 廣西藥用植物園，南寧，530000)

目的:探討復(fù)方益智顆粒對(duì)Aβ25-35導(dǎo)致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究該產(chǎn)品改善阿爾茨海默癥記憶功能障礙的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:取經(jīng)不同處理的PC12細(xì)胞分為正常對(duì)照組、Aβ25-35模型組、Aβ25-35+正常血清組、Aβ25-35+CYZG含藥血清組(不同濃度)。正常對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，Aβ25-35模型組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換含20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Aβ25-35+正常血清組：正常血清預(yù)處理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Aβ25-35+CYZG含藥血清組：不同濃度CYZG含藥血清預(yù)處理24 h后，加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：Aβ25-35時(shí)間依賴性地抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，不同濃度CYZG含藥血清對(duì)其造成的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，隨著含藥血清劑量的增加，細(xì)胞的存活率增加，生長(zhǎng)抑制率減少。Aβ25-35能顯著引起PC12細(xì)胞凋亡，不同濃度CYZG含藥血清對(duì)其造成的細(xì)胞凋亡有抑制作用。結(jié)論：復(fù)方益智顆粒對(duì)Aβ25-35引起的PC12細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，其神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制Aβ25-35引起的PC12細(xì)胞凋亡有關(guān)。

阿爾茨海默癥；Aβ25-35；細(xì)胞凋亡；中藥

復(fù)方益智顆粒是中泰聯(lián)合開發(fā)的具有改善記憶功能的中藥保健產(chǎn)品，處方由人參、絞股藍(lán)、三七等6味中藥組成，2012年已獲得生產(chǎn)批文和國(guó)家發(fā)明專利。前期動(dòng)物和人體試驗(yàn)表明，復(fù)方益智顆粒具有顯著的改善人體記憶功能的作用[1]；在小鼠跳臺(tái)、避暗、水迷宮3項(xiàng)試驗(yàn)中均被證明具有確切的改善記憶的作用[2]，可顯著改善老齡小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3]；復(fù)方益智顆粒對(duì)Aβ25-35致老年性癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害也具有明顯改善作用[4]。我們采用Aβ25-35誘導(dǎo)建立老年癡呆細(xì)胞模型，觀察益智顆粒對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷和凋亡的保護(hù)作用，以期揭示該產(chǎn)品改善阿爾茨海默病患者記憶功能障礙的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠20只，質(zhì)量300 g左右，雄性，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。許可證號(hào)：SYXK(湘)2014-0012。籠中鼠顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲食，每天給予12 h光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。所有動(dòng)物喂以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 細(xì)胞株 PC12大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.3 試劑及儀器 馬血清(Gibco，美國(guó))、青霉素-鏈霉素溶液(100X)(碧云天)、胎牛血清(Gibco，美國(guó))、胰蛋白酶(碧云天)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))DMSO(Amresco，美國(guó))、Aβ25-35(Sigma，美國(guó))、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))、MTT試劑盒(Sigma，美國(guó))、Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒(BD，美國(guó))。

倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)、流式細(xì)胞檢測(cè)儀(BD，美國(guó))、多功能酶標(biāo)儀(ThermoFisher，美國(guó))。

1.4 PC12細(xì)胞體外培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，10% FBS，1%抗生素(antibiotics/antimycotics(GibcoBRL)，2～3 d換液1次，細(xì)胞80%融合度時(shí)傳代。可按照1∶4傳代比例進(jìn)行，37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱。

1.5 含藥血清的制備 雄性SD大鼠20只，體重300左右g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和CYZG組，每組10只，CYZG組灌胃給予CYZG混懸液(14 mL/kg)，對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水，2次/d，2次之間間隔6 h，連續(xù)10 d，末次給藥2 h后腹主動(dòng)脈采血，收集血清，56 ℃水浴滅活補(bǔ)體，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜抽濾除菌，-20 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 AD細(xì)胞模型建立 采用Aβ的活性片段Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡建立AD的細(xì)胞模型。PC12細(xì)胞用含10%馬血清、5%胎牛血清、100U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～5 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞傳代，傳代時(shí)用0.25胰酶消化，顯微鏡下觀察待細(xì)胞突起開始收縮時(shí)加入含血清的培養(yǎng)基中和，移液槍吹散細(xì)胞。收集細(xì)胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min去上清，新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞接種24 h后吸去舊培養(yǎng)基，加入含Aβ25-35(20 μM)不含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 1)取經(jīng)不同處理的細(xì)胞分為8個(gè)組：對(duì)照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+正常血清組、Aβ25-35+CYZG血清40 μL組、Aβ25-35+CYZG血清60 μL組、Aβ25-35+CYZG血清80 μL組、Aβ25-35+CYZG血清100 μL組、Aβ25-35+CYZG血清120 μL組，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL。2)分別接種于96孔板中，每孔200 μL，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。3)將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)，培養(yǎng)細(xì)胞到適當(dāng)時(shí)間。4)對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；Aβ25-35組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換含20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；Aβ25-35+正常血清組：正常血清預(yù)處理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；Aβ25-35+CYZG血清組(40 μL,60 μL,80 μL,100 μL,120 μL)：CYZG含藥血清預(yù)處理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。5)向每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。6)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h。7)終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。8)每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。9)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解遞質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡 1)取經(jīng)不同處理的細(xì)胞分為8個(gè)組：對(duì)照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+正常血清組、Aβ25-35+CYZG血清40 μL組、Aβ25-35+CYZG血清80 μL組、Aβ25-35+CYZG血清120 μL組，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL。用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60%～70%，吸出舊培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求處理，繼續(xù)培養(yǎng)。2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。3)取5萬～10萬重懸的細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。4)加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。5)室溫(20～25 ℃)避光孵育10 min。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。6)1 000 g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。7)加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 復(fù)方益智顆粒對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響 見表1。

表1 不同濃度CYZG含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

注:與Aβ25-35組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 不同濃度CYZG含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

注：1：Aβ25-35組；2：Aβ25-35+正常血清組；3：Aβ25-35+CYZG血清40 μL組；4：Aβ25-35+CYZG血清60 μL組；5：Aβ25-35+CYZG血清80 μL組；6：Aβ25-35+CYZG血清100 μL組；7：Aβ25-35+CYZG血清120 μL組；抑制率(%)=1-實(shí)驗(yàn)組去除空白后OD值/對(duì)照組去除空白后OD值。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，Aβ25-35時(shí)間依賴性地抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，含藥血清對(duì)其修復(fù)作用有劑量依賴性，隨著含藥血清劑量的增加，細(xì)胞的存活率增加，生長(zhǎng)抑制率減少。PC12對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)低血清處理組為Aβ25-35+CYZG血清40 μL組；中血清處理組為Aβ25-35+CYZG血清80 μL組；高血清處理組為Aβ25-35+CYZG血清120 μL組。

2.2 復(fù)方益智顆粒對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞annexinV/PI染色情況顯示，Aβ25-35處理PC12細(xì)胞能夠顯著增加細(xì)胞凋亡率(與正常對(duì)照組比較，P<0.01)，Aβ25-35+正常血清處理組對(duì)Aβ25-35引起的細(xì)胞凋亡沒有明顯的影響，不同劑量CYZG含藥血清對(duì)Aβ25-35引起的細(xì)胞凋亡均可以起到明顯的抑制作用，Aβ25-35+CYZG40 μL組、Aβ25-35+CYZG血清80 μL組、Aβ25-35+CYZG血清120 μL組的凋亡率明顯下降(與Aβ25-35模型組比較，P<0.01)。

圖2 CYZG含藥血清對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞凋亡的影響

注：1：正常對(duì)照組，2：Aβ25-35組，3：Aβ25-35+正常血清組，4：Aβ25-35+CYZG血清組(低)，5：Aβ25-35+CYZG血清組(中)，6：Aβ25-35+CYZG血清組(高)。

圖3 各組細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)圖

注：P2-Q2：晚期凋亡細(xì)胞；P2-Q3：早期凋亡。

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)，是一種嚴(yán)重危害老年人身心健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、分析判斷力下降、意識(shí)模糊和智力逐漸喪失，最終導(dǎo)致生活不能自理[5]。其特征性病理變化為大腦皮質(zhì)萎縮，并伴有β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積，神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neuro Fibrillary Tangles，NFT)，大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑(Senile Plaque，SP)的形成[6-8]。目前，對(duì)于AD的發(fā)病機(jī)制有多種假說，其中“Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說”已為大多學(xué)者所接受，即各種原因所致的Aβ(β-amyloid)代謝異常，引起Aβ在腦組織的異常增多，在此過程觸發(fā)了與AD病理生理、生物化學(xué)相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如膽堿能神經(jīng)損害、突觸可塑性功能障礙等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損害并引起癡呆[9]。因此，Aβ作為一個(gè)重要的分子靶點(diǎn)，已經(jīng)成為治療阿爾茨海默病藥物研究與開發(fā)的重點(diǎn)[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用Aβ25-35處理PC12細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型。結(jié)果表明，Aβ25-35預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后，造成細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞的增殖；CYZG含藥血清預(yù)處理24 h后，細(xì)胞抑制率降低，不同濃度CYZG含藥血清均能顯著降低細(xì)胞抑制率，且呈劑量依賴性；提示CYZG可以有效的抑制Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的毒性，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

Aβ聚集是AD的早期變化之一，可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞死亡[11-12]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD患者腦內(nèi)出現(xiàn)大量神經(jīng)元丟失現(xiàn)象的重要原因之一[13-15]。本研究結(jié)果表明，Aβ25-35處理PC12細(xì)胞能夠顯著增加細(xì)胞凋亡率不同劑量CYZG含藥血清對(duì)Aβ25-35引起的細(xì)胞凋亡均可以起到明顯的抑制作用。本研究結(jié)果揭示復(fù)方益智顆粒可對(duì)抗Aβ25-35聚集導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡，具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(2016-10-17收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Neuroprotective Effect Research of Compound Yizhi Granule on the PC12 Cell Injury Model Induced by Aβ25-35

Hao Erwei1，2，3, Deng Jiagang2, Du Zhengcai2, Hou Xiaotao2, Miao Jianhua3

(1ThePost-DoctoralResearchStationofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China；2GuangxiMedicinalBotanicGarden,Nanning530000,China; 3GuangxiKeyLaboratoryofEfficacyScreeningofChineseMateriaMedica,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China)

Objective:To observe the protection effects of Fufang yizhi Granule on the cellular damage induced by the protein Aβ25-35,and to be the basis of further study on the mechanism of this product to improve the memory in Alzheimer′s disease. Methods: Different processing cells were divided into Normal control group, Aβ25-35model control group, Aβ25-35+Normal serum group, and Aβ25-35+CYZG serum group, then given different procedure. Normal control group: cultured with DMEM medium for 48 h, Aβ25-35model control group, 24 h after being cultured with DMEM medium, then added the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h. Aβ25-35+Normal serum group: 24 h after being cultured with DMEM medium contained normal serum, then add the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h, Aβ25-35+CYZG serum group: 24 h after being cultured with DMEM medium contained CYZG serum, then add the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h. Results: Protein Aβ25-35could time-dependently inhibit the growth of PC12 cells, CYZG serum of different concentrations had protective effect on the cellular damage, with the increase of the CYZG serum dosage, the cell survival rate increase, and growth inhibition rate decrease. Protein Aβ25-35could induce the apoptosis of PC12 cells, CYZG serum of different concentrations significantly inhibited the apoptosis. Conclusion: Fufang yizhi Granule could protect the PC12 from the damage induced by Protein Aβ25-35, the mechanism of neuroprotective effect of Fufang yizhi Granule may relate with the inhibition effect of apoptosis.

Alzheimer′s disease; Aβ25-35; Apoptosis; Chinese Materia Medica

廣西國(guó)際科技合作項(xiàng)目(編號(hào)：桂科合1347004-16)；廣西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：15-140-31)；廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)(編號(hào)：CICAR2015-Z1)

鄧家剛，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效篩選及中藥基礎(chǔ)理論研究；E-mail：dengjg53@126.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.006