不同培養(yǎng)基對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響

王 妍，杜春梅，2，姜忠元，董錫文，2*

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)微生物研究所，黑龍江佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)教務(wù)處，黑龍江佳木斯 154007)

不同培養(yǎng)基對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響

王 妍1，杜春梅1，2，姜忠元3，董錫文1，2*

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)微生物研究所，黑龍江佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)教務(wù)處，黑龍江佳木斯 154007)

[目的]研究培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響。[方法]采用平板插片培養(yǎng)方法，以黑木耳H29為試驗(yàn)材料，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸對(duì)鎖狀聯(lián)合菌絲比率促進(jìn)的最佳濃度。再通過(guò)正交試驗(yàn)確定其最佳組合。[結(jié)果]適當(dāng)濃度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸均能提高H29鎖狀聯(lián)合菌絲比率，其最佳組合為20 mg/mL葡萄糖、6 mg/mL蛋白胨、3.5 mg/mL丙氨酸。[結(jié)論]該研究為黑木耳的育種和實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

黑木耳；鎖狀聯(lián)合；培養(yǎng)基

黑木耳(Aurieuzariaauricular)真菌學(xué)分類(lèi)屬擔(dān)子菌綱木耳目木耳科，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與動(dòng)物性食物相當(dāng)，同時(shí)具有益氣補(bǔ)血、促進(jìn)免疫功能和抗癌等作用，兼具食用和藥用價(jià)值[1]。研究表明，鎖狀聯(lián)合是黑木耳菌絲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中明顯的指示特征，其對(duì)黑木耳的產(chǎn)量和生產(chǎn)周期有重要的作用[2]。關(guān)于環(huán)境因素及不同培養(yǎng)基成分對(duì)黑木耳菌絲生長(zhǎng)的影響已有報(bào)道，但是不同培養(yǎng)基對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率影響的研究還鮮有報(bào)道。鑒于此，筆者以黑木耳品種H29為試驗(yàn)材料，研究不同濃度的葡萄糖、蛋白胨及丙氨酸對(duì)其鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響，以期為黑木耳的育種和實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。供試菌株“黑微29”(H29)購(gòu)于黑龍江省科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基。PDA固體培養(yǎng)基[3]：馬鈴薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g、蛋白胨 5.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g、VB110.0 mg、瓊脂 20.0 g、水 1 000 mL、pH 5.5。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g、VB110.0 mg、瓊脂 20.0 g、水 1 000 mL、pH 5.5。碳源培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖(無(wú)氮培養(yǎng)基)。氮源培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的蛋白胨(無(wú)碳培養(yǎng)基)[4]。氨基酸培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的丙氨酸(Ala)[5]。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng)。用接種鏟將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.2.2 單因素試驗(yàn)。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸，使葡萄糖終濃度分別為0、10.0、20.0、30.0、40.0 mg/mL；蛋白胨終濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL；丙氨酸終濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL。將活化的菌種用打孔器取出5 mm的菌種塊，接種到含有不同濃度葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸的平板培養(yǎng)基中央(插片)[6-7]，各因素各水平設(shè)6個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。以添加馬鈴薯的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.3 正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選取最優(yōu)的濃度水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合所需葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸的濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，每個(gè)組合設(shè)置6個(gè)重復(fù)(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)

1.3 測(cè)定方法 培養(yǎng)12 d后，隨機(jī)選取每組5個(gè)平板培養(yǎng)基，取出插片用于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，記錄鎖狀聯(lián)合個(gè)數(shù)、菌絲數(shù)。鎖狀聯(lián)合菌絲比率=鎖狀聯(lián)合個(gè)數(shù)/菌絲數(shù)，加葡萄糖(蛋白胨、丙氨酸)的培養(yǎng)基鎖狀聯(lián)合菌絲比率=加葡萄糖(蛋白胨、丙氨酸)的培養(yǎng)基鎖狀聯(lián)合菌絲比率-對(duì)照培養(yǎng)基鎖狀聯(lián)合菌絲比率。

1.4 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，在不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基中，隨著葡萄糖濃度的增加，H29的鎖狀聯(lián)合菌絲比率呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，說(shuō)明添加一定濃度的葡萄糖對(duì)鎖狀聯(lián)合菌絲比率有促進(jìn)作用。當(dāng)葡萄糖的濃度為20 mg/mL時(shí)，鎖狀聯(lián)合菌絲比率最高；在不同濃度的蛋白胨培養(yǎng)基中，蛋白胨濃度的增加對(duì)H29的鎖狀聯(lián)合菌絲比率有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)?shù)鞍纂说臐舛葹?.0 mg/mL時(shí)，鎖狀聯(lián)合菌絲比率最高，低于或高于此濃度時(shí)，促進(jìn)作用呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此有利于H29鎖狀聯(lián)合菌絲比率提高的最佳蛋白胨濃度為5.0 mg/mL。在不同濃度的丙氨酸培養(yǎng)基中，隨著丙氨酸濃度的增加，H29的鎖狀聯(lián)合菌絲比率呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基中丙氨酸的濃度為3 mg/mL時(shí)，鎖狀聯(lián)合菌絲比率為0.924±0.230，達(dá)到最高值，說(shuō)明該濃度的丙氨酸對(duì)H29鎖狀聯(lián)合菌絲比率具有明顯的促進(jìn)作用。因此，可將該濃度選為該因子影響鎖狀聯(lián)合菌絲比率的最佳濃度。

表2 不同濃度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響

Table 2 Effects of glucose，peptone and alanine concentrations on the clamp-connection hyphae ratio ofAuriculariaauricular

種類(lèi)Type濃度Concentrationmg/mL鎖狀聯(lián)合菌絲比率Clamp?connectionhyphaeratio葡萄糖Glucose00．357±0．05010．00．517±0．02420．00．963±0．14730．00．589±0．06440．00．395±0．036蛋白胨Peptone00．260±0．0262．50．398±0．0365．01．004±0．1497．50．558±0．03910．00．376±0．03400．283±0．0691．00．434±0．045丙氨酸Alanine2．00．574±0．0453．00．924±0．2304．00．661±0．066

2.2 正交試驗(yàn) 由表3可知，影響“H29”鎖狀聯(lián)合菌絲比率的因素主次依次為A、B、C，即主要的影響因子為葡萄糖，次要的為蛋白胨，而丙氨酸的影響最小。方差分析表明，A和B 2個(gè)因素在α=0.05水平上對(duì)“H29”鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響存在顯著差異。因此，提高“H29”鎖狀聯(lián)合菌絲比率的最佳方案是A2B3C3，即葡萄糖20 mg/mL、蛋白胨6 mg/mL、丙氨酸3.5 mg/mL。

3 結(jié)論與討論

黑木耳菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)養(yǎng)分的需求是以含碳的物質(zhì)(如葡萄糖、蔗糖、淀粉等)、木質(zhì)素和含氮的物質(zhì)(如氨基酸、蛋白胨、蛋白質(zhì)等)為主。此外還需要少量的無(wú)機(jī)鹽(如鈣、磷、鐵、鉀、鎂等)[8-10]。有關(guān)于碳源、氮源、氨基酸等對(duì)黑木耳菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育的影響已有報(bào)道，但對(duì)于培養(yǎng)基的不同成分及不同濃度對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合的影響目前還鮮有報(bào)道。該試驗(yàn)選取的碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨、氨基酸為丙氨酸。葡萄糖為單糖，有研究表明相比于雙糖和多糖，黑木耳菌絲對(duì)單糖的吸收和利用較高；氮源為蛋白胨，蛋白胨屬?gòu)?fù)合氮源，培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)高壓滅菌后蛋白胨會(huì)分解成多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更有利于黑木耳菌絲的吸收利用[11]；氨基酸為丙氨酸，低濃度的丙氨酸有利于黑木耳菌絲的生長(zhǎng)且可促進(jìn)其形成耳基。該試驗(yàn)結(jié)果表明適當(dāng)濃度的葡萄糖、蛋白胨對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響較顯著，蛋白胨比葡萄糖的作用效果更為顯著，且用量也比葡萄糖少。由此可知，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率有明顯的促進(jìn)作用，在黑木耳生產(chǎn)中可以考慮適當(dāng)添加，以縮短黑木耳菌絲的培育周期。在黑木耳2、3級(jí)菌種的生產(chǎn)中是否需要添加適當(dāng)濃度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸需要進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)在提高黑木耳生產(chǎn)效率、增加栽培者經(jīng)濟(jì)收入上都具有重要的研究?jī)r(jià)值。

表3 葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸濃度正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 3 Concentration of glucose，peptone and alanine of orthogonal test

組合數(shù)Combinationnumber因素Factor∥mg/mL葡萄糖(A)Glucose蛋白胨(B)Peptone丙氨酸(C)Alanine與對(duì)照試驗(yàn)鎖狀聯(lián)合菌絲比率之差Differenceofclamp?connectionhyphaeratiocomparedwiththecontrol115．04．02．50．040215．05．03．00．869315．06．03．51．063420．04．03．01．131520．05．03．51．222620．06．02．51．813725．04．03．51．113825．05．02．50．535925．06．03．00．813K10．6570．7610．796K21．3890．8750．938K30．8201．2301．133R0．7320．4690．337

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Effects of Culture Medium on Clamp-connection Hyphae Ratio ofAurieuzariaauricular

WANG Yan1, DU Chun-mei1,2, JIANG Zhong-yuan3, DONG Xi-wen1,2*

(1. College of Life Sciences, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 2. Institute of Microorganisms, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 3. Office of Academic Affairs, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

[Objective] To study the effects of glucose, peptone and alanine in culture medium on clamp-connection hyphae ratio ofAurieuzariaauricular. [Method] WithA.auricularH29 as the test materials, plate culture method was adopted. The optimal concentrations of glucose, peptone and alanine that promoting the clamp-connection hyphae ratio were determined by single factor test. The optimal constitution was determined by orthogonal test. [Result] The appropriate concentrations of glucose, peptone and alanine could improve the clamp-connection hyphae ratio ofA.auricularH29. The optimal concentration combination was 20 mg/mL glucose, 6 mg/mL peptone and 3.5 mg/mL alanine. [Conclusion] This research provides references for the breeding and practical production ofA.auricular.

Aurieuzariaauricular; Clamp connection; Culture medium

佳木斯大學(xué)校長(zhǎng)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金研發(fā)項(xiàng)目(xzyf2014-17)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(LZZ2015-007)。

王妍(1990- )，女，黑龍江鶴崗人，碩士研究生，研究方向：黑木耳栽培及育種。*通訊作者，教授，博士，從事微生物學(xué)研究。

2016-11-09

S 646.6

A

0517-6611(2016)35-0049-02