活血化瘀中藥對糖尿病腎病大鼠腎臟保護及血清降鈣素基因相關肽的影響

鄭君芙

(天津市濱海新區中醫醫院內一科，天津 300451)

活血化瘀中藥對糖尿病腎病大鼠腎臟保護及血清降鈣素基因相關肽的影響

鄭君芙

(天津市濱海新區中醫醫院內一科，天津 300451)

目的 研究活血化瘀中藥對糖尿病腎病大鼠腎臟保護及血清降鈣素基因相關肽(CGRP)的影響。方法 SD大鼠分為正常組(n=16)、模型組(n=16)、中藥組(n=16)，模型組和中藥組利用單側腎切除加腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)造成糖尿病腎病大鼠模型。正常組和模型組灌服等容積蒸餾水。中藥組在單腎切除STZ誘導糖尿病腎病模型成模后灌胃活血化瘀中藥。第8、12周末分2批檢測24 h尿蛋白定量(24 hUTP)、血糖(Glu)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及體質量的變化，放射免疫法測定CGRP。結果 第8、12周末模型組24 hUTP、Glu、體質量與正常組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；第8、12周末中藥組24 hUTP與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；第8、12周末中藥組Glu與模型組相比有下降趨勢，但無統計學意義(P>0.05)；第8、12周末中藥組體質量與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；第12周與第8周相比，中藥組體質量有上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。第8、12周末模型組BUN與正常組同期比較差異有統計學意義(P<0.05)；第12周末中藥組BUN與模型組相比有下降趨勢，第12周與第8周相比中藥組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著造模時間的延長，模型組血Cr含量比正常組稍有增加，但無統計學意義(P>0.05)，第12周末中藥組與模型組相比有下降趨勢，無統計學意義(P>0.05)；第8、12周末模型組和中藥組的CGRP升高，與正常組同期比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且中藥組CGRP與模型組同期比較差異有統計學意義(P<0.05)，第12周與第8周中藥組CGRP比較升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 活血化瘀中藥對單腎切除STZ誘導糖尿病腎病大鼠有降低蛋白尿，調節血糖代謝，保護腎功能的作用。活血化瘀中藥對單腎切除STZ誘導糖尿病腎病大鼠能明顯擴張腎臟血管，增加腎臟血流量，改善腎臟血液微循環，有效提高腎臟濾過率，減輕腎臟病理損害，從而達到保護腎功能的作用。

糖尿病, 實驗性；糖尿病腎病；中藥療法；大鼠；動物

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)屬糖尿病微血管病變范疇,是一種臨床常見的繼發性腎臟病,據統計DN占糖尿病患者死亡率的60%[1],糖尿病患者死于DN腎衰竭者為非糖尿病患者的17倍[2]。DN的病理變化主要是腎小球硬化和腎小管壞死。現代醫家普遍認為DN存在血液高凝狀態，瘀血內阻是導致DN發生、發展的重要因素[3]。認為血瘀存在于疾病發展的始終，活血化瘀治則應該貫穿于治療的始末。降鈣素基因相關肽(CGRP)是目前已知體內最強的舒血管多肽, 腎血管床中存在豐富的CGRP受體,CGRP通過與這些受體結合而產生強大的舒張腎血管作用。因此，我們建立DN大鼠模型，用藥物干預的方法，通過探討活血化瘀中藥對DN大鼠腎臟保護及CGRP的影響，為活血化瘀中藥用于臨床治療DN提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器 Sprague-Dawleg(SD)系雄性大白鼠60只，體質量(200±20)g，SPF/ VAF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma公司產品，北京萊博生物實驗材料研究所分裝)，臨用前用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH 4.2，4 ℃配成2%溶液。美國強生穩靈型血糖儀SmartScan。活血化瘀中藥由丹參30 g、鬼箭羽30 g組成，藥物購自天津中醫藥大學附屬保康醫院中藥房，按比例稱取后加水濃煎提取至2.5 g生藥/mL的濃度，備用(由天津中一制藥廠提供)。SYNCHRON CX-7全自動生化分析儀。CGRP放免試劑盒，由天津九鼎醫學生物工程有限公司提供。

1.2 造模方法 給予普通飼料、自由飲水，適應性飼養1周后按體質量隨機分為正常組(18只)、造模組(模型組、中藥組共42只)。造模組參照1978年Steffes MW[4]等報道的造模方法加以改進。以10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，行左腎摘除術。方法：常規背部消毒，背部切口1～1.5 cm，暴露左腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結扎左腎門血管，切除左腎，縫合切口。術后1周，按45 mg/kg體質量腹腔內注射STZ，臨用前用0. 1 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH 4.2，4 ℃配成2%溶液，72 h后尾靜脈取血測血糖(Glu)(用美國強生穩靈型血糖儀SmartScan)，Glu>16.7 mmol/L者確定為糖尿病模型制作成功(2只大鼠未成模被排除)。剩余大鼠按Glu隨機分為模型組和中藥組。中藥組造模成功第1 d開始給藥，大鼠給藥劑量按藥理學實驗動物給藥方法(馬氏定理)計算，均以成人劑量/kg的15倍[20 g/kg·d]灌胃。正常組和模型組灌服等容積蒸餾水。各組每日灌胃1次，直至8周和12周處死。各組大鼠分籠喂養于天津中醫藥大學動物實驗室,每籠4～5只,自由飲水,以大鼠維持飼料飼養。

1.3 標本收集 于第8周(每組各8只)、12周(每組各8只)末實驗結束前2 d將大鼠置于清潔的代謝籠中，收集24 h尿液，量取尿量，尿標本離心后測24 h尿蛋白定量(24 hUTP)；股動脈取血，分離血清測量Glu、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)；股動脈取血3 mL，注入含7.5%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 40 μL 和抑肽酶40 μL的試管里，混勻，4 ℃ 3 600 r/min離心10 min后分離血清，放入-20 ℃保存備用(測定CGRP)。

1.4 檢測指標和方法 動物處死前稱量體質量；尿標本離心后測24 hUTP，Glu、BUN、Cr、TG、TC用全自動生化分析儀測定。

CGRP測定應用放射免疫法，步驟：將冰凍保存的血清樣本在冷水中復融混勻，再次4 ℃ 3 600 r/min離心10 min，取上清200 μL檢測，在r計數器上測定cmp數,根據標準管結果在半對數坐標紙上作出標準曲線,并查出樣品值。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 正常組大鼠反應敏捷，活動正常，毛色光澤，飲食、飲水正常，大便呈顆粒狀，尿色淡黃；模型組和中藥組大鼠活動減少，反應遲鈍，毛發灰黯欠光澤，多飲多食，消瘦，尿量增多，大便稀溏等。但8周后，中藥組大鼠狀態好轉，毛發光澤較前好轉，體質量維持且有小幅度增長，尿量減少。正常組死亡大鼠2只，模型組死亡4只，中藥組死亡4只。

2.2 常規指標

2.2.1 3組8、12周末24 hUTP、Glu及體質量比較 見表1。

表1 3組8、12周末24 hUTP、Glu及體質量比較

周數n正常組模型組中藥組FP24hUTP(mg)8811.95±3.9795.69±96.33*11.91±5.89△6.6530.00612811.32±2.2176.39±73.13*22.29±13.18△4.5400.024Glu(mmol/L)887.16±0.3239.62±4.33*32.99±12.91*36.8660.00021287.32±0.5832.85±15.27*28.94±9.11*13.7440.0002體質量(g)88431.9±44.9294.7±89.7*248.4±28.8*24.8010.0004128433.2±13.2255.6±60.0*○293.4±51.7*△○15.4780.009

與正常組同期比較,*P<0.05；與模型組同期比較，△P<0.05； 與本組8周體質量比較，○P<0.05

由表1可見，第8、12周末模型組24 hUTP、Glu、體質量與正常組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；第8、12周末中藥組24 hUTP與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；第8、12周末中藥組Glu與模型組相比有下降趨勢，但無統計學意義(P>0.05)；第8、12周末中藥組體質量與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；第12周與第8周相比，中藥組體質量上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.2 3組8、12周末BUN、Cr、TG、TC及CGRP比較 見表2。

表2 3組8、12周末BUN、Cr、TG、TC及CGRP比較

周數n正常組模型組中藥組FPBUN(mmol/L)887.05±0.5314.63±1.77*20.12±5.85*△28.4480.00011287.01±0.2313.03±3.34*○11.59±2.46*○○10.2150.001Cr(μmol/L)8823.56±1.5124.17±5.4222.13±2.641.0150.3812821.28±1.3523.83±5.6419.37±3.622.8460.082TG880.76±0.212.77±1.65*1.79±2.41△2.7080.0411280.77±0.382.27±0.12*1.17±0.61△6.1630.008TC881.84±0.262.45±0.33*1.96±0.48△5.3100.0141281.88±0.122.30±0.21*2.10±0.266.7340.006CGRP(ng/L)8817.84±3.8927.03±5.38*34.92±15.30*△4.4210.02012818.32±3.1431.10±11.2647.74±19.67*△○8.2260.002

與正常組同期比較，*P<0.05；與模型組同期比較，△P<0.05； 與本組8周末CGRP比較，○P<0.05；與本組8周BUN比較，○○P<0.05

由表2可見，第8、12周末模型組BUN與正常組同期比較差異有統計學意義(P<0.05)；第12周末中藥組BUN與模型組相比有下降趨勢，第12周與第8周相比中藥組下降，差異有統計學意義(P<0.01)；隨著造模時間的延長，模型組血Cr含量比正常組稍有增加，但無統計學意義(P>0.05)，第12周末中藥組與模型組相比有下降趨勢，無統計學意義(P>0.05)；第8、12周末模型組TG、TC與正常組同期比較差異均有統計學意義(P<0.05)，第8、12周末中藥組TG與模型組相比有下降趨勢，比較差異有統計學意義(P<0.05)，第12周末中藥組TG與模型組相比有下降趨勢，第12周與第8周相比中藥組下降有統計學意義(P<0.01)，第8周中藥組與模型組比較TC下降(P<0.05)，第12周中藥組與模型組比較無統計學意義(P>0.05)；第8、12周末模型組和中藥組的CGRP升高，與正常組同期比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且中藥組CGRP與模型組同期比較差異有統計學意義(P<0.05)，第12周與第8周中藥組CGRP比較升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

CGRP在體內主要分布于中樞和外周神經系統及某些器官組織中,是目前已知體內最強的舒血管多肽,在許多疾病的發病中有重要意義。CGRP對內皮素(ET)具有生物學拮抗作用。DN在持續高糖情況下，最終可形成糖化終產物(AGE)，AGE與腎小球系膜細胞上特異性受體結合,能增加系膜細胞對細胞因子的釋放和細胞外基質的產生,基底膜增厚,進而導致腎小球肥大和腎小球硬化的發生,加重病變[5]。在腎小球濾過率方面,內皮素-1(ET-1)對入球小動脈及出球小動脈有相似的收縮效應,所以跨毛細血管靜水壓沒有或有輕微的下降,而ET-1導致的腎小球系膜細胞收縮則可能是導致腎小球毛細血管超濾系數下降的原因。AGE的小分子量的降解產物能使近端腎小管內皮細胞表達ET的mRNA增加210%,從而使內皮細胞產生ET-1明顯增加[6]。腎臟的腎小球毛細血管內皮細胞是合成ET的重要來源[7]。劉紅等[8]通過研究糖尿病大血管病變與CGRP的關系，得出結論糖尿病患者ET、CGRP升高,認為CGRP較正常人升高主要與血管病變有關,糖尿病患者在臨床尚未出現血管病變時即已有血管內皮功能損害,而CGRP在機體內皮損傷時,對缺血缺氧的心、腦、腎器官組織起到一種保護作用。CGRP升高,是機體對血管損害ET升高的一種代償反應。CGRP有抑制腎小球系膜細胞收縮的作用,能夠增加腎小球毛細血管超濾系數,從而改善腎功能[9]。

西醫治療DN主要依靠降糖、降脂以及血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑類藥物的應用控制其發展[10],中醫藥在治療DN方面顯示出明顯的優勢。DN的發生、發展是糖尿病遷延不愈的后果，傷陰耗氣，痰、郁、熱、瘀互相膠結，積聚于腎臟，導致腎小球硬化、腎纖維化。耿嘉等[3]認為瘀血內阻是導致DN發生、發展的重要因素。臨床上適當使用活血祛瘀藥物確可提高療效，延緩腎功能惡化進程。因此，我們根據臨床經驗并結合現代中藥藥理研究篩選出鬼箭羽、丹參，進一步探討活血化瘀中藥防治DN的作用機制。丹參味苦，微寒，具有活血祛瘀、涼血消癰、養血安神的作用。鬼箭羽氣微,味微苦澀,性寒,無毒,入厥陰經，具有破血、通經、殺蟲、散瘀止痛等功效。二藥合用，增強了活血通經、破血祛瘀止痛的作用。現代藥理研究表明，鬼箭羽主含黃酮類活性成分，具有降低血糖、調節血脂、改善血流變等作用，其水煎部分降糖、降脂[11]；降低血清胰島素和胰高血糖素，能夠刺激胰島素分泌[12]；改善糖耐量、血液流變學和微循環，糾正脂質代謝的紊亂，提高超氧化物歧化酶的活力[12]；可以減少腎小管上皮細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率，降低N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性，提高堿性磷酸酶(ALP)的活力[13]，通過降低血清TG、低密度脂蛋白、TC含量水平，調整脂質代謝紊亂，減少泡沫細胞的形成和刺激細胞外基質增生，從而改善腎小球硬化[15]；對腎小管上皮細胞具有一定保護作用，可能有預防和減輕DN并發癥的作用[15]。丹參主要成分為脂溶性多種丹參酮和水溶性原兒茶酚醛和兒茶酚醛的衍生物—丹參素,二者均能擴張收縮微動脈,加速血流,并具有抗血栓形成,抗血小板聚集,黏附及促進纖維蛋白降解作用[16]；可降低TG[17]，抑制脂質過氧化[18]；減輕蛋白非酶糖化對腎臟的損傷和防止腎小球肥大[19]。

實驗結果表明，第8周和12周模型組大鼠24 hUTP、Glu明顯升高，BUN升高，體質量下降，且與正常組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。考慮DN模型建立成功，經過活血化瘀中藥治療后，①與模型組相比Glu下降不明顯，提示降Glu可能不是活血化瘀中藥腎保護作用的主要機制。但隨著治療時間延長至12周，Glu進一步下降，雖沒有統計學意義，提示我們若是延長治療周期，Glu可能會進一步下降。②治療后24 hUTP下降明顯，有統計學意義(P<0.05)；中藥組BUN先升后降，且12周和8周比較有統計學意義(P<0.05)；Cr變化不大。提示活血化瘀中藥是通過降低蛋白尿來改善腎功能。③第8、12周末模型組TG與正常組同期比較差異有統計學意義(P<0.05)，第8、12周末中藥組TG與模型組比較有下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)，且蛋白尿下降和血脂下降成正相關，說明活血化瘀中藥對DN大鼠降脂療效顯著。④第8周和12周末中藥組CGRP有大幅度的提高，與正常組和模型組比較有統計學意義(P<0.05)。第12周與第8周中藥組CGRP比較升高，差異有統計學意義(P<0.05)。提示活血化瘀中藥對DN大鼠的血瘀狀態有明顯改善作用，對血管有擴張作用，通過增加腎臟的血流量，改善腎血液循環及血液灌注，保護腎功能。

綜上所述，活血化瘀中藥主要是通過降低尿蛋白，增加腎臟的血流量，改善腎血液循環及血液灌注，減輕腎組織病理損害,延緩腎小球的硬化來保護DN大鼠的腎功能，對DN有著良好的治療作用。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of blood activating and stasis-removing Chinese medicine on kidney protection and serum calcitonin generelated peptide in rats with diabetic nephropathy

ZHENGJunfu.

FirstDepartmentofInternalMedicine,BinhaiNewAreaHospitalofTraditionalChineseMedicineinTianjinCity,Tianjin300451

Objective To observe the effects of blood activating and stasis-removing Chinese medicine on kidney protection and serum calcitonin generelated peptide (CGRP) in rats with diabetic nephropathy (DN). Methods The SD rats were divided into normal group (n=16), DN model group (n=16), Chinese medicine group (n=16). The model and Chinese medicine group were established by uninephrectomy and intraperitoneal injection of streptozotocin. Rats in normal and model group received equivalent distilled water. The Chinese medicine group received blood activating and stasis-removing Chinese medicine by gavage after the DN models established successfully. The 24 hour urine proteinuria (24 hUTP), blood glucose (Glu), blood urine nitrogen (BUN), creatinine (Cr) and body weight at the 8 weeks and 12 weeks of treatment were measured. The CGRP was measured by radioimmunoassay. Results There were statistical differences on 24 hUTP, Glu and body weight after 8 weeks and 12 weeks of treatment between model and normal groups (P<0.05). There were statistical differences on 24 hUTP after 8 weeks and 12 weeks of treatment between Chinese medicine and model groups (P<0.05). The Glu after 8 weeks and 12 weeks of treatment in Chinese medicine group with a downward tendency as compared with that in model group, but with no statistical difference (P>0.05). There were statistical differences on body weight after 8 weeks and 12 weeks of treatment between Chinese medicine and model groups (P<0.05). The body weight at the 8 weeks and 12 weeks showed an upward tendency in Chinese medicine group, with statistical difference (P<0.05). There were statistical differences on BUN after 8 weeks and 12 weeks between model and normal group (P<0.05). The BUN at the 12 weeks in Chinese medicine group showed a downward tendency as compared with that in model group, and the BUN in Chinese medicine group showed a downward tendency between the 12 weeks and the 8 weeks, with statistical differences (P<0.05). As the modeling time went on, the Cr in model group was higher than normal group, but with no statistical difference (P>0.05). The Cr at the 12 weeks in Chinese medicine group showed a downward tendency as compared with that in model group, with no statistical difference (P>0.05). The CGRP at 8 and 12 weeks were increased in model and Chinese medicine group as compared with those in normal group at the same period, with statistical differences (P<0.05). There were statistical differences on CGRP between Chinese medicine and model group at the same period (P<0.05). The CGRP at 12 weeks in Chinese medicine group was increased as compared with the 8 weeks (P<0.05). Conclusion Blood activating and stasis-removing Chinese medicine can decrease proteinuria, regulate glycometabolism and protect kidney function in mono-nephrectomy STZ-induced DN rats. Blood activating and stasis-removing Chinese medicine can obviously dilate vessel of kidney, increase kidney blood flow, effectively enhance filtration rate, and reduce kidney damage, thus achieve the protection of kidney functions.

Diabetes; Experimental; Diabetic nephropathy; Traditional Chinese medicine; Rat; Animal

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.11.021

鄭君芙(1980—)，女，主治醫生，碩士。研究方向：中醫消化內科。

R-332；R587.1；R692.390.531

A

1002-2619(2016)11-1688-05

2016-08-15)