不同NaCl含量、培養(yǎng)基和微量元素對分枝桿菌SP-3降解菲的影響研究

黃玉杰，張聞，傅曉文，高永超，孔學，郭書海，2，王加寧*

(1.山東省科學院生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014；2.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016 )

【環(huán)境與生態(tài)】

不同NaCl含量、培養(yǎng)基和微量元素對分枝桿菌SP-3降解菲的影響研究

黃玉杰1，張聞1，傅曉文1，高永超1，孔學1，郭書海1，2，王加寧1*

(1.山東省科學院生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014；2.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016 )

研究了分枝桿菌SP-3在不同NaCl含量、培養(yǎng)基和微量元素中降解菲的效果影響。結(jié)果表明，分枝桿菌SP-3在NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%時對菲的降解率達到最大，為87.41%；菌株在LB液體培養(yǎng)基、改良LB液體培養(yǎng)基和改良的無機鹽液體培養(yǎng)基中對菲的降解率都達到了80%以上，三者之間無顯著性差異；Fe2+、Zn2+濃度分別在100 μmol/L和5 μmol/L，Mg2+在100 μmol/L時，可以提高菌株對菲的降解能力，而Cu2+隨著濃度的增加，能夠抑制菌株對菲的降解。研究結(jié)果有助于該菌應用于多環(huán)芳烴降解的生物技術中，以提高菌株對菲等多環(huán)芳烴的降解能力。

菲；微量元素；培養(yǎng)基；降解率；分枝桿菌

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是一類廣泛分布于環(huán)境中的持久性有機污染物，具有致畸、致癌和致突變的作用，給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來潛在的危害[1-3]。PAHs的降解過程包括光解、水解和生物降解等多種途徑，其中，生物降解在土壤PAHs降解的過程中發(fā)揮著重要作用，越來越受到人們的關注[4-6]。研究表明，環(huán)境中對PAHs的降解主要是細菌類，這些菌可以利用菲等四環(huán)以下的PAHs作為唯一碳源生長[7-9]。Story等[10]從被PAHs污染的土壤中篩選出一株降解菌Sphingomonassp.GY2B，該菌株能夠降解99.8%的菲、萘等四環(huán)以下的PAHs。

PAHs生物降解過程中，受到多種因素的影響，包括碳氮源、溫度、酸堿度、土壤鹽堿度、各種營養(yǎng)成分和微量元素等[11-13]。本實驗室分離得到分枝桿菌SP-3，在營養(yǎng)無機鹽培養(yǎng)基中對菲的降解率達到了90%以上[14]。本文在對其進行發(fā)酵及培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎上，對該菌進行了NaCl含量、菲降解用培養(yǎng)基及不同微量元素方面的研究，為今后該菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

本實驗中所用的菌株為分枝桿菌SP-3，該菌株的分離及培養(yǎng)見文獻[14]。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH值7.2，121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

改良LB培養(yǎng)基：上述LB培養(yǎng)基中，NaCl 增加至10 g/L。

固體LB培養(yǎng)基：上述LB培養(yǎng)基中加入10 g/L瓊脂。

無機鹽培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，CaCl20.1 g/L，F(xiàn)eCl30.02 g/L，pH值為7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

改良無機鹽培養(yǎng)基：上述無機鹽培養(yǎng)基中添加5 g/L蛋白胨，2.5 g/L酵母粉。

菲培養(yǎng)基的制備：取150 mL三角瓶，滅菌后向每個空瓶中加入5 g/L的菲母液(0.25 g菲溶于50 mL丙酮配置而成)0.4 mL，放入搖床中恒溫培養(yǎng)18 h，使其中的丙酮揮發(fā)干凈。然后將已經(jīng)滅菌的40 mL無機鹽培養(yǎng)基倒入上述含菲的三角瓶中，菲的最終濃度為50 mg/L。

1.1.3 儀器與試劑

Waters Alliance 2695液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters SymmetryTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)；高效液相色譜層析流動相所用甲醇為色譜純(美國Thermo Fisher公司)；實驗用水為超純水(屈臣氏)；二氯甲烷為分析純(北京化工廠)；對照品菲(美國Supelco公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菲的標準曲線的繪制

將菲用甲醇稀釋成濃度為1、2、4、6、8、10 mg/L 的標準系列，進行液相色譜測定，記錄色譜圖，以相對應的菲的濃度為橫坐標(x)，對應的峰面積為縱坐標(y)，線性回歸繪制標準曲線，y=320.37x-12.448，R2=1。

1.2.2 菲的測定

將二氯甲烷按照體積比1:1加入到樣品中，搖床振蕩30 min，取出后超聲10 min，利用分液漏斗進行液液萃取，分離并收集有機相，萃取重復3次。用烘干的無水Na2SO4去除有機相中多余水分，然后抽濾并旋蒸，氮氣吹至近干，甲醇定容至10 mL，用高效液相色譜測定樣品中的菲含量。色譜條件：流動相為甲醇-水(90:10,V/V)，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，運行時間6 min， 激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長360 nm，增益8，PDA測波長為249.7 nm。繪制菲的標準曲線，采用外標法，按照下列公式計算菲降解率：

上式中，X為降解率，A為對照培養(yǎng)基中菲濃度，B為接菌培養(yǎng)液中菲濃度。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

1.2.4 種子液的制備

單菌落接種在LB試管中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取出種子液備用。將種子液在4 ℃、4 000 r/min,離心10 min，利用無菌水清洗菌體2次，最終懸浮菌體至1×107CFU/mL，備用。

1.2.5 不同NaCl含量對SP-3降解菲的影響

按照無機鹽培養(yǎng)基體積的2%接種量接菌，將菌體分別接種到NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%、2%、3%、4%的改良無機鹽培養(yǎng)基中，以沒有接菌的無機鹽培養(yǎng)基作為對照，每組處理重復3次。樣品30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)一周，用液相色譜檢測菲的含量。

1.2.6 不同培養(yǎng)基對菌株SP-3降解菲的影響

培養(yǎng)基的配制：無機鹽培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、改良無機鹽培養(yǎng)基、改良LB培養(yǎng)基同上。按照培養(yǎng)基體積的2%接種量接菌，以沒有接菌的培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復3次，將樣品30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)一周，用液相色譜檢測菲的含量。

1.2.7 不同濃度的金屬離子對菌株SP-3降解菲的影響

實驗采用Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+4種微量元素，各元素濃度見表1。按不同比例將微量元素添加到無機鹽培養(yǎng)基中，按照培養(yǎng)基體積的2%接種量接菌，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復3次，30 ℃搖床培養(yǎng)一周，利用液相色譜檢測菲的含量。

表1 微量元素濃度(單位：μmol/L)

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl含量對菲降解的影響

分枝桿菌SP-3在不同NaCl含量下對菲的降解率見圖1。結(jié)果顯示，不同含量的NaCl對菲降解的影響不同，在質(zhì)量分數(shù)為1%的NaCl中菌株SP-3對菲的降解效果較好，降解率達到了87.41%，隨著NaCl含量的提高，菌株SP-3對菲的降解能力不斷地降低，這表明NaCl對菌株的降解率有著較為明顯的影響，隨著NaCl濃度的提高，其對菲的降解效果受到一定程度的抑制。

2.2 不同培養(yǎng)基對菲降解率的影響

分枝桿菌SP-3在不同培養(yǎng)基中對菲的降解能力如圖2所示。結(jié)果表明，分枝桿菌SP-3在LB液體培養(yǎng)基、改良LB液體培養(yǎng)基和改良的無機鹽液體培養(yǎng)基中對菲的降解率都達到了80%以上，三者之間無顯著性差異。在無機鹽培養(yǎng)基中的降解率最小，只有43.70%。上述結(jié)果表明額外的營養(yǎng)物質(zhì)，例如蛋白胨、酵母抽提物等對菌株的降解能力有較好的促進作用。

圖1 NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株 SP-3 降解菲的影響 Fig.1 Impact of different NaCl concentrations on phena-nthrened egradation of strain SP-3

圖2 不同培養(yǎng)基對菌株SP-3降解菲的影響 Fig.2 Impact of different media on phenanthrene degradation of strain SP-3

2.3 不同濃度的微量元素對菲降解的影響

2.3.1 不同濃度Cu2+對菲降解率的影響

圖3顯示不同濃度Cu2+對分枝桿菌SP-3降解菲的影響不同，在不添加Cu2+和Cu2+濃度為0.10 μmol/L時，分枝桿菌SP-3的降解率分別是48.56%和47.85%，二者之間0.05水平上差異不顯著。隨著Cu2+濃度的提高，菌株SP-3對菲的降解率降低，對菌株的降解能力產(chǎn)生了抑制作用，在Cu2+濃度為5 μmol/L時，降解率只有9.54%。推測Cu2+含量的增加影響了菌株的生長，繼而影響到菌株對菲的降解能力。

2.3.2 不同濃度Fe2+對菲降解率的影響

不同濃度Fe2+對菲降解率的影響見圖4，結(jié)果顯示不同濃度的Fe2+對菲降解的影響略有差異，濃度在100～250 μmol/L 之間可以提高菌株SP-3對菲的降解能力，因此在培養(yǎng)基中可以添加少量的Fe2+。

圖3 不同濃度Cu2+對分枝桿菌SP-3降解菲的影響Fig.3 Impact of different Cu2+concentrations on phenanthrene degradation of Mycobacterium SP-3

圖4 不同濃度Fe2+對分枝桿菌SP-3降解菲的影響Fig.4 Impact of different Fe2+concentrations on phenanthrene degradation of Mycobacterium SP-3

2.3.3 不同濃度Mg2+對菲降解率的影響

不同濃度Mg2+對菲降解率的影響如圖5所示，從圖中可以看出，Mg2+對菲的降解影響較大，在濃度為100～500 μmol/L時，菌株對菲的降解率均在60%以上，尤其是濃度為100 μmol/L時，降解率為66.83%，可見少量添加Mg2+可以提高菌株對菲的降解能力。

2.3.4 不同濃度Zn2+對菲降解率的影響

如圖6所示，Zn2+濃度在0.1～2.5 μmol/L之間時，菌株對菲的降解效果不明顯，當Zn2+濃度為5 μmol/L時，菲降解率達到了52.15%，說明添加少量的Zn2+可以促進菌株對菲的降解率。

圖5 不同濃度Mg2+對分枝桿菌SP-3降解菲的影響 Fig.5 Impact of different Mg2+concentrations on phenan-threne degradation of Mycobacterium SP-3

圖6 不同濃度Zn2+對分枝桿菌SP-3降解菲的影響 Fig.6 Impact of different Zn2+concentrations on phenanthrene degradation of Mycobacterium SP-3

3 討論

菲作為一種典型的PAHs，在環(huán)境中分布廣泛，利用微生物將其轉(zhuǎn)化成為無害物質(zhì)的生物修復技術受到廣泛關注。目前有關環(huán)境因素對菲降解影響的研究，主要集中在碳氮源、溫度、pH等方面，而菲降解過程中影響因素有很多，各個因素的影響程度不同，其中許多的機理和過程尚未完全明確。

本實驗室從石油污染土壤中分離獲得一株革蘭氏陽性細菌SP-3，對其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了初步研究，本文在上述基礎上，對該菌進行了NaCl含量、菲降解用培養(yǎng)基及不同微量元素方面的研究。研究發(fā)現(xiàn)，菌株SP-3在NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%時，降解率可達到87.41%，隨著NaCl含量的提高，其本身對菲的降解能力不斷地降低，這表明NaCl對菌株的降解率有著較為明顯的影響，鹽度升高會抑制菌株的生長速率和菌株對菲的降解速率，其原因是NaCl含量增加，導致菌株內(nèi)部溶液濃度低于外界，致使菌體內(nèi)水分大量流失引起生物體內(nèi)的化學反應環(huán)境發(fā)生變化，最終抑制菌體生命活性，導致非嗜鹽微生物的修復效率明顯降低，修復能力喪失。通過不同培養(yǎng)基對菲降解率的影響，發(fā)現(xiàn)額外添加少量營養(yǎng)物質(zhì)可以提高菌株對菲的降解能力，這主要是因為額外的營養(yǎng)物質(zhì)可以在最初接菌后，較快地促進菌株的繁殖速度，提高菌株數(shù)量，使其不斷地與周圍環(huán)境快速地進行物質(zhì)交換。

菌株在菲降解過程中，除了受到鹽和營養(yǎng)物質(zhì)的影響外，不同微量元素對菲的降解也有明顯的影響。例如，F(xiàn)e2+是微生物生長代謝所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在菌體的生長過程中主要參與一些氧化還原反應，是電子傳遞鏈的組成部分，因此培養(yǎng)基中添加少量 Fe2+可以提高菌株對菲的降解能力。微生物生長代謝過程中，還受到Zn2+、Mg2+、Cu2+等各種離子的影響，例如，菌體內(nèi)部的各類生化反應，需要Zn2+、Mg2+、Cu2+等的參與，本研究中發(fā)現(xiàn)少量添加上述離子可以提高菌株對菲的降解能力，例如，Cu2+濃度為0.10 μmol/L時，分枝桿菌SP-3的降解率為47.85%。但過量金屬離子會抑制菌株的生長，甚至產(chǎn)生毒害作用，本文中發(fā)現(xiàn)隨著Cu2+濃度的提高，影響了菌株的生長，繼而抑制到菌株對菲的降解能力。通過上述對不同NaCl含量、培養(yǎng)基和微量元素中降解菲的效果研究，為今后開發(fā)利用分枝桿菌SP-3提供了可靠的理論依據(jù)。

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Impact of different salinity, culture media and trace elements on phenanthrene degradation ofMycobacteriumsp. SP-3

HUANG Yu-jie1, ZHANG Wen1, FU Xiao-wen1, GAO Yong-chao1, KONG Xue1, GUO Shu-hai1, 2, WANG Jia-ning1*

( 1. Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China;2. Applied Ecology Institute, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China)

∶We addressed degradation effect of phenanthrene byMycobacteriumsp. SP-3 for different salinity, culture media and trace elements. Results show that degradation rate of phenanthrene is maximum, 87.41%, when salt concentration is 1%. Degradation rate of phenanthrene is more than 80% in LB liquid media, modified LB and modified inorganic salt liquid media, no significant difference among them. Fe2+concentration of 100 μmol/L, Zn2+concentration of 5 μmol/L and Mg2+concentration of 100 μmol/L can increase degradation ability ofMycobacteriumsp. SP-3 to phenanthrene. However, Cu2+can inhibit degradation ability of the strain to phenanthrene with the increase of its concentration. The results will be benefit for the application of the strain to biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and the increase of its biodegradation capability to polycyclic aromatic hydrocarbons such as phenanthrene.

∶phenanthrene; trace elements; culture medium; degradation rate;Mycobacteriumsp.

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.016

2016-03-22

山東省科學院先導科技專項(2013)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA06A210)；泰山學者工程專項經(jīng)費資助；山東省自然科學基金(BS2015HZ011)

黃玉杰(1977—)，女，副研究員，研究方向為污染土壤生物修復。

*通信作者。E-mail:wangjn@sdas.org

X172

A

1002-4026(2016)06-098-06