生物酶對五氯聯苯降解的初步研究

季蕾，陳貫虹，傅曉文，黃玉杰，王加寧，張強

(山東省科學院生態研究所, 山東省應用微生物重點實驗室, 山東 濟南 250014)

【環境與生態】

生物酶對五氯聯苯降解的初步研究

季蕾，陳貫虹，傅曉文，黃玉杰，王加寧，張強*

(山東省科學院生態研究所, 山東省應用微生物重點實驗室, 山東 濟南 250014)

多氯聯苯(PCBs)是具有代表性的持久性有機污染物(POPs)，其氯代數目越多，降解越難。本文以分離篩選的6株PCBs降解細菌為材料，制備了含有NADH輔酶再生系統關鍵酶甲酸脫氫酶(FDH)的PCBs降解復合酶，研究了其對PCBs的降解效果。結果表明，Pseudomonassp. MGB11胞內酶/FDH復合酶對五氯聯苯PCB114的降解率在10 h內可達69.4%，對于高毒性、難降解的高氯PCBs的污染修復具有應用價值。

五氯聯苯; 降解復合酶; 甲酸脫氫酶

工業化學品多氯聯苯(PCBs)是首批被列入國際持久性有機污染物( persistent organic pollutants， POPs)公約的污染物，具有持久性、半揮發性、長距離遷移性、生物蓄積性和高毒性的污染特性[1]，其氯化程度越高，越難分解。五氯聯苯作為高氯PCBs，與低氯代物相比，具有更高的毒性和持久性[2]。目前，POPs污染事故仍不斷發生，及時、有效地修復污染環境，對人類健康和經濟發展至關重要。

微生物降解因其低耗、易于實現原位修復、環境安全和純生態過程的顯著優點[3]，是公認的治理PCBs污染的一種環保而有效的手段。好氧微生物能夠把低氯PCBs(nCl<5)氧化為氯代苯甲酸，但很難降解高氯PCBs(nCl≥5)[4]；厭氧生物過程將高氯PCBs還原成低氯PCBs，但不能破壞苯環結構[5]，PCBs好氧開環過程需要聯苯雙加氧酶等NADH依賴型氧化還原酶[6-8]。NADH的持續供給可通過高效、低成本的甲酸/FDH(甲酸脫氫酶) 輔酶再生系統實現[9]。

本研究針對微生物降解高氯PCBs周期長、效率低的問題，以五氯聯苯為降解底物，選用實驗室自行分離篩選的6株PCBs降解好氧細菌，制備含有NADH輔酶再生系統關鍵酶FDH的PCBs降解復合酶，提高高氯PCBs的降解效率，以實現對PCBs污染的快速修復。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

聯苯(國藥集團)；PCB114(2,3,4,4',5-Pentachlorobiphenyl)(Sigma-Aldrich)；正己烷為色譜純；其他化學試劑為分析純。

6株PCBs降解菌均由本實驗室分離并保存，分別為Burkholderiasp. MGB112、Sphingomonassp. MGB12、Pseudomonassp. MGB11、Rhodococcussp. MGB10、Arthrobactersp. MGB09、Pseudomonassp. VM14。

表達博伊丁假絲酵母fdh基因的基因工程大腸桿菌E.coliBL21-fdh由本實驗室構建，用于FDH的制備。

誘導培養基：蛋白胨2 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.1 g/L，NaCl 0.2 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，聯苯1.0 g/L，pH=7.0。

ZYP培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，KH2PO46.8 g/L，(NH4)2SO43.3 g/L，CaCl20.02 g/L，MgSO40.24 g/L，0.5%甘油，葡萄糖0.5 g/L，乳糖2 g/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCBs降解酶制備

6株PCBs降解菌分別在30 ℃、150 r/min條件下用誘導培養基培養48 h，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，分別收集菌體及上清液，菌體用10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.5)稀釋至原濃度的1/20，在250 W、3 s/5 s條件下進行細胞破碎20 min，離心，上清為粗酶液。

1.2.2 FDH制備及活性檢測

E.coliBL21-fdh在37 ℃、150 r/min條件下經ZYP培養基培養24 h，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，菌體稀釋至原濃度的1/20，在200 W、3 s/3 s條件下進行細胞破碎6 min，離心，上清為粗酶液。

FDH活性檢測：反應體系中甲酸鈉1 670 mmol/L，NAD 16.7 mmol/L，10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.5)2 mL，加入適當稀釋的酶液1 mL，蒸餾水補足4 mL，30 ℃反應5 min，測定反應前后340 nm處的吸光值，根據標準曲線計算酶活力。酶活力定義為1 min催化產生1 μmol NADH所需的酶量為1 U。

1.2.3 菌株對PCBs降解

不同菌株分別在誘導培養基中培養至飽和后，各取2 mL菌液8 000 r/min離心5 min，菌體用滅菌蒸餾水清洗2次，重懸后分別接種至50 mL 濃度為1 mg/L 的PCB114溶液中，置于搖床中30 ℃、150 r/min培養。培養7 d后測定PCB114的降解率。

1.2.4 PCBs的酶降解

反應體系為10 mL，其中10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.5)5 mL，PCBs降解酶1 mL，FDH 酶液1 mL，蒸餾水補足至10 mL。PCB114 終濃度1 mg/L，甲酸鈉1 670 mmol/L，30 ℃水浴反應8 h后測定降解率。

1.2.5 PCBs萃取及檢測

反應體系中加入10 mL正己烷，充分震蕩后超聲5 min，轉移至分液漏斗，靜置分層后分離上下相，萃取3次，合并萃取液，經無水硫酸鈉脫水，旋蒸后定容至5 mL，GC-MS法測定PCB114含量。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱，進樣口溫度280 ℃，柱溫100 ℃保持1 min后，升至280 ℃保持4 min，載氣流速為1 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL。質譜條件：離子源為電子轟擊源(EI)，能量70 eV，阱溫220 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲5 min。定量分析選擇SIM模式。

2 結果與分析

2.1 菌株對PCBs的降解

6株PCBs降解菌經1 g/L聯苯誘導，可達到的飽和生物量如表1所示。Pseudomonassp. MGB11的菌體密度最大，其OD600值為2.05；Pseudomonassp. VM14生物量達飽和時的OD600值僅為0.57，6株細菌在誘導培養基中所達到的飽和菌體密度均較低。收集菌體轉接至PCB114培養基中，7 d后有3株菌的降解率達到20%以上，其中Pseudomonassp. MGB11降解率最大，為29%(表1)，其降解能力與生物量保持一致。

表1 PCBs降解菌在誘導培養基中的飽和生物量和PCB114降解率

2.2 復合酶對PCBs的降解

E.coliBL21-fdh經誘導產酶后，收集細胞并破碎，獲得的粗酶液FDH酶活力為0.633 U/mL。分別制備6株PCBs降解菌的粗酶液，與FDH粗酶按照1:1(V/V)的比例進行復配，添加至PCB114濃度為1 mg/L的降解體系，反應8 h后，PCB114降解率結果如表2所示。

表2 不同復合酶對PCB114的降解率

注：CK為MGB112粗酶液(未添加FDH)。

結果顯示，8 h后MGB112、MGB11、VM14對PCB114降解率分別為57.1%、65.7%、40%，其中Pseudomonassp. MGB11胞內酶/FDH復合酶對PCB114的降解率最高(65.7%)。Burkholderiasp. MGB112胞內酶/FDH復合酶的PCB114降解率(57.1%)與其胞內酶單獨作用8 h相比(7.5%)提高了6.6倍。

2.3 PCBs降解酶在細胞不同部位的分布

菌株Pseudomonassp. MGB11經培養后，對其培養液、菌體破碎液的PCB114降解能力進行比較，結果顯示，在8 h內，Pseudomonassp. MGB11胞內酶/FDH對PCB114的降解率達67.5%，而添加胞外上清液/FDH的體系中未檢測到降解活性，表明具有PCBs降解活性的酶主要存在于胞內，而不分泌到胞外培養液中。Ruiz-Aguilar等[10]報道，來源于細菌的PCBs降解酶大多為胞內酶，而白腐真菌可分泌胞外過氧化物酶降解

圖1 復合酶Pseudomonas sp. MGB11胞內酶/FDH對PCB114的降解曲線Fig.1 Degradation curve of intracellular enzyme of Pseudomonas sp. MGB11 /FDH to PCB114

PCBs，與好氧細菌相似，降解速率與含氯量成反比，降解四氯代以上的PCBs仍比較困難。

2.4 復合酶對PCB114的降解曲線

在短時間內實現PCB114高效降解的復合酶Pseudomonassp. MGB11胞內酶/FDH，對1 mg/L PCB114的降解曲線見圖1。結果顯示，經8～10 h降解后，復合酶對底物的降解速率趨于穩定，10 h時PCB114降解率達69.4%。

3 討論

目前關于高氯代PCBs降解的相關研究報道較少，多為低氯PCBs降解的相關研究。胡星等[11]篩選獲得的假單胞菌SYC01對四氯聯苯PCB77(0.5 mg/L)、PCB52(0.1 mg/L)的降解率分別為34%、68%。Sierra等[12]分離的好氧菌Janibactersp. MS3-02對四氯聯苯Aroclor1242在7 d內的降解率為70%。本文中，對更難降解的毒性類二噁英類PCBs[13]，降解酶系僅需10 h即可降解69.4%，具有更快的降解速率。此外，微生物降解高氯PCBs的過程，一般需要先經過厭氧脫氯后，更易于好氧開環降解生成小分子。本文所使用的好氧微生物胞內酶，直接通過好氧過程可將高氯PCBs降解，操作工藝簡單，適用于原位污染修復。

在PCBs污染修復方面，厭氧脫氯的研究僅局限于菌種的分離和脫氯機理的研究，而在分子生物學及酶學方面仍處于空白階段，好氧生物降解主要集中在PCBs降解菌株的篩選、降解機理及降解相關的酶和基因方面的研究[14]，對于構建具有輔酶再生功能的高氯PCBs降解復合酶的相關研究尚屬首次[15]。

利用分離篩選、富集或基因工程構建獲得的具有特定降解功能的微生物，通過發酵工程及酶工程手段，提取相關酶或酶系，制備復合酶或經固定化后，用于PCBs污染土壤、水體及有機污染場地的修復，是極具應用潛力的環境治理途徑。本研究將輔酶再生系統關鍵酶FDH引入PCBs降解復合酶的構建，實現好氧條件下對高氯代PCBs的高效降解，周期短、降解能力強、成本低且操作工藝簡單，在污染環境治理、生態修復方面具有應用價值。

[1]董玉瑛, 馮霄. 持久性有機污染物分析和處理技術研究進展 [J]. 環境污染治理技術與設備, 2003, 4(6): 49-55.

[2]SAFE S, BANDIERA S, SAWYER T, et al. PCBs: structure-function relationships and mechanism of action [J]. Environmental Health Perspectives, 1985, 60: 47-56.

[3]周際海, 黃榮霞, 樊后保, 等. 污染土壤修復技術研究進展 [J]. 水土保持研究, 2016, 23(3): 366-372.

[4]ABRAMOWICZ D A. Aerobic and anaerobic biodegradation of PCBs: A review [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 1990, 10(3): 241-251.

[5]韋朝海, 張小璇, 任源, 等. 持久性有機污染物的水污染控制: 吸附富集、生物降解與過程分析 [J]. 環境化學, 2011, 30(1): 300-309.

[6]劉云興, 王國梁. 多氯聯苯生物降解技術研究進展 [J]. 環境科學與管理, 2012, 37(12): 72-75.

[7]曲媛媛, 許炳雯, 叢培, 等. 兩相體系中固定化聯苯雙加氧酶全細胞產靛藍特性研究 [J]. 大連理工大學學報, 2013, 53(3): 340-345.

[8]BRENNER V, ARENSDORF J J, FOCHT D D. Genetic construction of PCB degraders [J]. Biodegradation, 1994, 5(3/4): 359-377.

[9]黃志華, 劉銘, 王寶光, 等. 甲酸脫氫酶用于輔酶NADH 再生的研究進展 [J]. 過程工程學報, 2006, 6(6): 1011-1016.

[10]RUIZ-AGUILAR G M L, FERNNDEZ-SNCHEZ J M, RODRGUEZ-VZQUEZ R,et al. Degradation by white-rot fungi of high concentrations of PCB extracted from a contaminated soil [J]. Advances in Environmental Research, 2002, 6(4): 559-568.

[11]胡星, 杜麗婷, 王斐, 等. 一株聯苯基質篩選菌的生理及多氯聯苯降解特性 [J]. 上海大學學報 (自然科學版), 2016, 22(2): 188-196.

[12]SIERRA I, VALERA J L, MARINA M L, et al. Study of the biodegradation process of polychlorinated biphenyls in liquid medium and soil by a new isolated aerobic bacterium (Janibacter sp.) [J]. Chemosphere, 2003, 53(6): 609-618.

[13]SAFE S. Toxicology, structure-function relationship, and human and environmental health impacts of polychlorinated biphenyls: progress and problems [J]. Environmental health perspectives, 1993, 100(4): 259-268.

[14]PIEPER D H, SEEGER M. Bacterial metabolism of polychlorinated biphenyls [J]. Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2008, 15(2/3): 121-138.

[15]FURUKAWA K, FUJIHARA H. Microbial degradation of polychlorinated biphenyls: Biochemical and molecular features [J] . Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 105(5): 433-449.

Pilot study on bioenzyme degradation to pentachlorodiphenyl

JI Lei, CHEN Guan-hong, FU Xiao-wen, HUAGN Yu-jie, WANG Jia-ning, ZHANG Qiang*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

∶ Polychlorinated biphenyls (PCBs) is a representative of persistent organic pollutants (POPs). More its chlorinated number leads to more difficult its degradation . We prepared PCBs compound degrading enzyme of key enzyme formate dehydrogenase (FDH) of NADH coenzyme regeneration system with isolated 6 PCBs degradation bacteria strains as materials. We address its degrading effect to PCBs. Results indicate that degradation rate of Pseudomonas sp. MGB11/FDH compound enzyme to pentachlorodiphenyl PCB114 is up to 69.4% within 10 h. It therefore has application value in the repair for high chlorine PCBs pollutants with high toxicity and low degradability.

∶ pentachlorodiphenyl; compound degrading enzyme; formate dehydrogenase

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.015

2016-08-08

國家國際科技合作專項(2014DFE90100)；山東省自然科學基金(ZR2015YL008, BS2015HZ011)

季蕾(1985—)，女，博士，研究方向為生態修復。

*通信作者。E-mail：zhbuaiji@sina.com。

X53

A

1002-4026(2016)06-094-04