基于CLSI EP12-A2文件要求的乙型肝炎五項定性檢測性能驗證

唐恩躍，何增品，崔曉花，楊永平，熊秋霞△

(1.云南省保山市人民醫院檢驗科 678000；2.昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科，昆明 650032)

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·論 著·

基于CLSI EP12-A2文件要求的乙型肝炎五項定性檢測性能驗證

唐恩躍1，何增品2，崔曉花2，楊永平2，熊秋霞2△

(1.云南省保山市人民醫院檢驗科 678000；2.昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科，昆明 650032)

目的 對昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科免疫室酶聯免疫吸附試驗(ELISA)定性項目乙型肝炎(乙肝)五項進行性能驗證。方法 采用ELISA，通過稀釋乙肝五項各項目強陽性標本得到臨界值濃度(C50)并驗證其是否正確；采用各個項目C50 -20%～+20%濃度范圍的重復性實驗驗證其結果是否包含C5～C95區間；用C50 +20%濃度驗證檢測限；常規手工操作試驗和TECAN全自動酶免檢測兩種方法檢測10例陽性和10例陰性標本，對其結果進行方法學比較及分析。結果 5個項目C50驗證正確；C50 -20%～+20%濃度范圍包含了C5～C95區間；檢測限驗證通過；5個項目兩種方法檢測結果一致性檢驗Kappa系數均為1。結論 本實驗室乙肝五項定性檢測使用方法及試劑盒相關性能均驗證合格,常規手工操作試驗方法和TECAN全自動酶免檢測方法兩種方法學比較結果一致性較好。

乙肝五項定性檢測； 性能驗證； 酶聯免疫吸附試驗

近年來，各大醫院實驗室將通過ISO15189實驗室質量和能力的認可納入到了實驗室的發展規劃中。在質量體系的構建中，對試驗方法進行方法學性能驗證是實驗室技術要求中非常重要的一環，在2013年4月實施的ISO15189補充文件CNAS-CL39實驗室質量和能力的認可準則在免疫學檢驗領域的應用中，對免疫學定性檢驗方法的性能驗證內容提出了具體的要求[1]。定性項目的性能評價包括重復性評價(分析物濃度接近臨界點時的重復性實驗、批內重復性、批間重復性)、方法學比較(包括未知臨床診斷的方法學比較和已知臨床診斷的方法學比較)、檢測限驗證、特異性驗證等。其中最主要的是分析物濃度接近臨界點時的重復性實驗和方法學比較兩項評價。美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)頒布的EP12-A2文件《定性項目的性能評價》提出定性檢測重復性須驗證3個濃度值的臨床標本，即C50(臨界點)、C5(低于C50濃度20%)和C95(高于C50濃度20%)。(1)C50:最佳條件下，處于和接近臨界值的分析物濃度，多次重復檢測此濃度的單一標本時，將獲得50%的陽性結果和50%的陰性結果；(2)C5：檢測濃度為C5的分析物時，將產生5%的陽性結果，用濃度C95的標本進行重復性檢測時，將持續得到陽性結果[2]。昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科免疫室參照EP12-A2文件對乙型肝炎(乙肝)五項進行分析物接近臨界點時的重復性實驗和方法學比較兩項性能評價，同時驗證檢測限。

1 材料與方法

1.1 標本選擇

1.1.1 質控品 陰性血清(自配)和標準血清質控品:HBsAg臨界質控品0.2 IU/mL(201504002),乙肝表面抗原(HBsAg)0.5 IU/mL(201404002)，乙肝表面抗體(HBsAb) 10 mIU/mL(201411002)，乙肝e抗原(HBeAg) 1 NCU/mL(201404002)，乙肝e抗體(HBeAb) 1 NCU/mL(20148001)，乙肝核心抗體(HBcAb)2 IU/mL(201409002)均產自康徹斯坦公司。

1.1.2 分析物接近臨界點時的重復性實驗

1.1.2.1 定性檢測重復性須驗證3個濃度值的臨床標本，即C50(臨界點)、C5(C50-20%)和C95(C50+20%)。

1.1.2.2 如何獲得系統或試劑的臨界點(C50)：檢測試劑或系統說明書可能會注明分析物的臨界濃度。如果臨界濃度未知，可將陽性標本進行梯度稀釋，然后對他們進行重復檢測以確定能夠獲得50%陽性和50%陰性結果的對應稀釋度，這一對應稀釋度的分析物濃度即為臨界點(C50)。

1.1.3 方法學比較 收集常規檢測標本20例，其中陽性標本7例，弱陽性標本3例，陰性標本10例。

1.2 試劑與試劑 HBsAg檢測試劑(批號201503081)、HBsAb檢測試劑(批號201506081)、HBeAg檢測試劑(批號201502021)、HBeAb檢測試劑(批號201412411)、HBcAb檢測試劑(批號201506081)均產自上海科華。儀器為瑞士Tecan公司生產的Tecan Freedom Evolyzer-2全自動酶免一體機、Thermo Multiskan MK3酶標儀；深圳匯松公司生產的PW-960全自動酶標洗板機，儀器均按ISO15189質量體系技術要求校準。

1.3 方法

1.3.1 室內質控 如性能驗證在10 d內完成，每次試驗質控品重復檢測2次，共提供20次重復檢測結果；如果性能驗證超過20 d，則每一批次都要對每份質控品進行單次檢測，總計提供20次重復結果。

1.3.2 分析物接近臨界點時的重復性實驗 將每個項目S/CO值在3左右的陽性標本用0.9%的生理鹽水進行倍比稀釋，將各稀釋度進行40次重復檢測(每個項目C50濃度OD值接近CUT OFF值)，重復檢測每個項目的C50-20%、C50+20%濃度標本各40次，確定每一濃度標本結果陽性和陰性的百分比。實驗操作和結果判斷嚴格按照說明書進行。

1.3.3 檢測限驗證 用C95濃度的標本，重復檢測40次。

1.3.4 方法學比較 設定手工操作、MK3比色為評價方法，TECAN全自動酶免檢測方法為靶方法，驗證其符合率，分別用常規手工操作試驗方法和TECAN全自動酶免一體機同時檢測20例標本，分布于10 d內，按常規方法檢測。

1.4 判斷標準

1.4.1 室內質控 不合格批次在10 d內不應超過1次或20 d內不超過兩次，如若超出，立即停止檢測工作并咨詢試劑制造商以確定原因并采取糾正措施。

1.4.2 分析物接近臨界點時的重復性實驗 判斷標準見表1，若C50驗證合格,則說明C50估計正確,若C50-20%、C50+20%驗證合格，則說明(C50-20%)～(C50+20%)濃度包含了C5～C95的區間。

表1 分析物接近臨界點時的重復性實驗判斷標準

1.4.3 檢測限驗證 C95濃度的標本重復檢測40次陽性結果≥36/40則驗證通過。

1.4.4 統計學處理 計算Kappa系數評價其一致性，Kappa系數大于等于0.75，說明兩種方法一致性較好，Kappa系數在0.40～0.75則兩種方法一致性一般，Kappa系數小于0.40兩種一致性較差。計算公式為Kappa系數=(Po-Pe)/(1-Pe)，其中Po是實際一致比，Pe是期望一致比。

2 結 果

2.1 分析物濃度接近臨界點的重復性驗證 對各項目C50、C5、C95濃度各進行40次測試，5個項目均驗證通過，說明5個項目C50-20%～C50+20%的濃度包含了C5～C95的區間。見表2。

表2 分析物濃度接近臨界點的重復性驗證結果[n/n(%)]

2.2 檢測限驗證 5個項目在C95濃度時均驗證通過。見表3。

表3 檢測限驗證結果[n/n(%)]

2.3 方法學比較 5個項目20例標本用常規手工操作試驗方法和TECAN全自動酶免一體機檢測陽性符合率和陰性符合率全部為100.0%，5個項目Kappa系數全部為1，表明5個項目常規手工操作試驗方法和TECAN全自動酶免一體機檢測結果一致性較好。

3 討 論

ISO15189：2007準則作為指導實驗室建立質量體系的綱領性文件，其第5.5.2條款指出實驗室應評估所選用方法和程序，在用于醫學檢驗之前應證實其可給出滿意結果[2]。對定性實驗而言，臨界值是唯一的醫學決定水平，它的高低直接關系試驗的成敗[3]。用濃度接近臨界值的標本作為評價材料比用強陽性或低陰性標本更能發現檢測誤差[4]。根據EP12-A2文件《定性項目的性能評價》要求，乙肝五項須進行分析物接近臨界點時的重復性實驗和方法學比較兩項性能評價，其他的可以選做，不作強制要求。

由于最佳條件不易獲得，實驗室準確估計C50比較困難，昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科免疫室按照EP12-A2文件要求，乙肝五項各個項目的C50通過稀釋各個項目的強陽性標本得來，5個項目的C50驗證結果在47.5%～60.0%，全部驗證正確。在確定了C50后，對5個項目C50+20%的濃度各進行40次檢測，陽性率均在95.0%及以上；對5個項目C50-20%的濃度各進行40次檢測，陰性率都在95.0%及以上，驗證通過，說明5個項目的(C50-20%)～(C50+20%)濃度包含了C5～C95的區間。C5～C95區間的寬度暗示了定性試驗的精密度,因為其反映了重復性檢測結果不一致的濃度范圍,C5～C95的區間越窄,代表方法越好[4]。同時，5個項目在C95驗證通過的情況下也說明5個項目檢測限也驗證通過。

當實驗室同時使用2套以上的檢測系統檢測同一項目時，必須保證兩者檢測結果的一致性[5]。本室對各項目的10例陽性標本和10例陰性標本用常規手工操作試驗方法和TECAN全自動酶免一體機檢測來驗證兩個方法的一致性，各個項目的陽性符合率和陰性符合率均為100.0%，通過計算Kappa系數來評價其一致性，5個項目兩種方法檢測一致性較好。

本實驗室乙肝五項定性檢測使用方法及試劑盒相關性能均驗證合格,常規手工操作試驗方法和TECAN全自動酶免檢測兩種方法學比較結果一致性較好。

[1]中國合格評定國家認可委員會．醫學實驗室質量和能力認可準則在臨床免疫學檢驗領域的應用說明[S]．北京：中國合格評定國家認可委員會，2012．

[2]ClincalandLaboratoryStandardsInstitute.EP12-A2Userprotocolforevalutionofqualitativetestperformance；approvedguideline[S].PA,USA:CLSI,2009.

[3]中國合格評定國家認可委員會．ISO15189：2007醫學實驗室質量和能力的專用要求[S]．北京：中國合格評定國家認可委員會，2008．

[4]周輝，張治國，杜春英，等．Bact/Alert3D系統與常用檢測方法的比較[J]．臨床肺科雜志，2009，14(7)：902-903．

[5]黃嫵姣，黃憲章，莊俊華，等．CLSIEP12-A2文件在HBeAb定性檢測性能評價中的應用[J]．檢驗醫學，2012，27(11)：900-903．

Performance validation of 5- item qualitative detection of hepatitis B based on requirements of EP12-A2 CLSI file

TANGEnyue1，HEZengpin2，CUIXiaohua2，YANGYongping2，XIONGQiuxia2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，BaoshanMunicipalPeople′sHospital,Baoshan，Yunnan678000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To perform the performance verification of 5-item qualitative detection of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) in the immunology room of laboratory department of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University.Methods The ELISA method was adopted.The strong positive samples of hepatitis B 5 items were diluted to the critical value concentration (C50) and its correction was verified;the repeated experiments with the C50 -20%-+20% concentration range for the various items were adopted to verify whether the results including the C5-C95 interval;the detection limit was verified by using the C50 +20% concentration;10 positive and 10 negative specimens were detected by the conventional manual operating test and TECAN fully automatic enzyme immunoassay detection,then the obtained results were performed the methodological comparison and analysis.Results The 5-item C50 verification was correct;the C50 -20%-+20% concentration range included the C5-C95 interval;the verification of detection limit was passed;the Kappa coefficient of 5-item consistency test in the results detected by two methods was 1.Conclusion The application method of hepatitis B 5-item qualitative detection and related performance of reagent kit all are qualified by verification.The methodological comparison results of the routine manual operation test and TECAN fully automatic enzyme immunoassay display good consistency.

five qualitative detection of hepatitis B; performance verification; enzyme linked immunosorbent assay

唐恩躍，男，主管技師，主要從事生化檢驗研究。△

，E-mail:asan_1123@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.022

A

1673-4130(2016)24-3443-03

2016-09-04

2016-10-23)