多重耐藥肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的檢測和分析

王鵬鯤，陳定強，俞 輝

(廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣州 510120)

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·論 著·

多重耐藥肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的檢測和分析

王鵬鯤，陳定強，俞 輝

(廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣州 510120)

目的 研究多重耐藥肺炎克雷伯菌臨床分離株的碳青霉烯酶的流行情況。方法 收集該院從2007年1月至2012年12月臨床分離的151株多重耐藥肺炎克雷伯菌，并對其藥敏結果進行歸納整理，用碳青霉烯酶表型試驗進行檢測，再用聚合酶鏈反應(PCR)檢測已知的碳青霉烯酶基因，并對擴增產物進行DNA測序，確定其基因型。結果 在151株多重耐藥肺炎克雷伯菌中，通過改良Hodge試驗篩選出12株可能產碳青霉烯酶的菌株，其中有1株的金屬酶試驗為陽性，該12株菌經PCR擴增及測序確定產碳青霉烯酶菌株有5株，金屬酶陽性株為IMP-4型金屬酶，另外4株產碳青霉烯酶菌株為KPC-2型。結論 近年來該院多重耐藥肺炎克雷伯菌出現了產碳青霉烯酶菌株，臨床應根據藥敏結果合理選用碳青霉烯類藥物，以減少耐藥菌株的產生。

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯酶； 多重耐藥； 聚合酶鏈式反應

肺炎克雷伯菌是最重要的醫院感染條件致病菌之一，可引起典型的原發性肺炎，也可引起肺外感染，該菌容易產生超廣譜β-內酰胺酶，可攜帶多重耐藥的質粒，在細菌耐藥性傳播中有重要作用[1]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床的使用增加，近幾年世界各地陸續出現耐藥株，產碳青霉烯酶是碳青霉烯類藥物耐藥的重要原因之一，其可隨質粒或整合子等移動元件在不同種屬菌株間傳播的特性引起了高度的關注。在腸桿菌科細菌中，耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌的檢出率也不斷增加[2]。為了解本院肺炎克雷伯菌產碳青霉烯酶的流行情況，同時也為醫院感染防控和規范碳青霉烯類抗菌藥物用藥提供實驗室依據，本文對本院臨床分離的151株多重耐藥肺炎克雷伯菌進行碳青霉烯酶基因的分析。

1 材料與方法

1.1 材料來源 實驗菌株為本院從2007年1月至2012年12月臨床分離的151株多重耐藥的肺炎克雷伯菌，細菌耐藥性及鑒定均經過VITEK-2全自動細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)分析鑒定。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922，金屬酶陽性菌株RP01和Hodge試驗陽性菌株KP1為實驗室保存的菌株。

1.2 實驗試劑 DNA Marker和PCR配套試劑購自Takara公司，瓊脂糖和溴化乙錠購自北京鼎國公司，引物由上海英濰捷基公司合成;藥敏紙片亞胺培南紙片IPM、厄他培南紙片ETP和空白紙片購自Oxoid公司；M-H瓊脂培養基、哥倫比亞血瓊脂培養基均購自梅里埃微生物制品有限公司；

1.3 改良Hodge實驗 將大腸埃希菌ATCC25922和24 h血平板上的單個菌落分別制備菌懸液，比濁至0.5號麥氏管，再用生理鹽水把已配好的大腸埃希菌的菌懸液稀釋10倍，用無菌拭子浸入菌懸液中，在管壁上擠干，均勻涂于整個M-H平板表面，中間貼厄他培南ETP紙片，每個M-H平板接種4株菌株，并做好陰性對照(大腸埃希菌ATCC25922)和陽性對照(產KPC的肺炎克雷伯菌KP1)，無菌接種環自紙片外緣向平板邊緣畫線，35 ℃孵育16～18 h后觀察結果，結果判斷：ETP紙片抑菌圈內出現待檢菌矢狀生長者為產碳青霉烯酶菌株。

1.4 雙紙片協同試驗和組合紙片法篩選金屬酶 取MHT實驗中已比濁好的待測菌的菌懸液，用無菌拭子浸入菌懸液中，在管壁上擠干，分別均勻涂于整個M-H平板表面，在平板的一端貼亞胺培南(IPM,10 μg)藥敏紙片，在距紙片2 cm處貼一空白紙片，并在空白紙片上面加入4 μL 0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，再在距離IPM紙片4 cm處另貼一IPM紙片，再滴加4 μL 0.5 mmol/L EDTA溶液，35 ℃培養過夜。結果判斷：IPM紙片抑菌圈在靠近滴加EDTA空白紙片抑菌圈有明顯擴大者或滴加EDTA的IPM紙片的抑菌環直徑大于4 mm則為產金屬酶株。

1.5 PCR和DNA測序 按照文獻[3]報道的序列和方法，針對已知的11種碳青霉烯酶基因合成引物進行PCR檢測。產物經純化回收后送上海英俊生物科技公司進行基因測序，測序結果在NCBI網上進行Blast比對分析。

2 結 果

2.1 菌株藥敏試驗結果 151株肺炎克雷伯菌的藥敏情況見表1。共有超廣譜 β-內酰胺酶(ESBL)陽性菌93株，ESBL陰性菌58株，產ESBL的陽性率為62%。藥敏分析表明，產ESBL株對青霉素類、第一和第三代頭孢菌素類高度耐藥，耐藥率均高于90%(第三代頭孢替坦除外，為19%)，但對第四代頭孢耐藥率為77%；對單環類的氨曲南耐藥率高達100%，而對喹諾酮類、磺胺類藥物耐藥性也較高，為70%左右；對加酶抑制劑復合藥氨芐西林/舒巴坦的耐藥率也高達94%，而對頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為37%和30%；產ESBL對亞胺培南高度敏感，敏感度為99%,對厄他培南的敏感率為78%。在2009～2012年收集到的71株菌中，產ESBL株有47株，美洛培南的敏感率為87%，非產ESBL株有24株，美羅培南的敏感率為96%。本研究顯示，除厄他培南、亞胺培南、美羅培南和左旋氧氟沙星外，產ESBL株均比非產ESBL株的耐藥性高。

表1 151株肺炎克雷伯菌耐藥性分析(%)

2.2 改良Hodge試驗和金屬酶試驗結果 在151株肺炎克雷伯菌中，Hodge試驗陽性的有12株，占7.9%，這些菌株可能產碳青霉烯酶；陰性的有139株，占92%，陰陽性對照見圖1，且在該12株菌中，雙紙片協同試驗和組合紙片法同時為陽性的細菌有1株， 說明該菌株可能產金屬酶。

2.3 PCR電泳結果及測序 12株Hodge試驗陽性結果經PCR擴增后有5株確證為產碳青霉烯酶菌株，其中有4株為KPC型，其陽性率為2.6%，1株為IMP型，陽性率為0.7 %。該5株菌的PCR產物電泳結果見圖1和圖2。PCR產物測序的結果表明，4株產KPC型菌株均攜帶KPC-2基因亞型，而1株產IMP型菌株攜帶IMP-4基因亞型。

注：1～4為含KPC基因的菌株；M為DNA Marker。

圖1 KPC基因PCR結果

注：1為含IMP基因的菌株；M為DNA Marker。

圖2 IMP基因PCR結果

3 討 論

近年來由于抗菌藥物的濫用，尤其是β-內酰胺類抗菌藥物，以致產ESBL的肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物的耐藥性上升，如碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上使用的增加，對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株被越來越多的報道。碳青霉烯類藥物對質粒介導的ESBL、染色體及質粒介導的頭孢菌素酶(AmpC)高度穩定，但其也可被金屬β-內酰胺酶水解滅活，造成碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。而本研究的藥敏結果顯示，經PCR確證試驗為產碳青霉烯酶的5株菌中，4株KPC型的厄他培南、亞胺培南和美洛培南的耐藥率均為100%，其ESBL也均為陽性，而1株IMP型的厄他培南、亞胺培南和美洛培南的敏感率均為100%，且ESBL為陰性，這5株菌對其他常用抗菌藥物均高度耐藥，由資料可推測，產KPC酶可能是本院的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制，文獻報道KPC-2型的肺炎克雷伯菌在我國廣泛存在，但產金屬酶的報導相對較少[3-4]。而本研究所檢測到的5株耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌中，KPC-2型的有4株，占80%，IMP-4型的有1株，僅占20%，這一結果也與該報導相一致。由于本研究先用改良Hodge試驗篩選出產碳青霉烯酶的耐藥株，而改良Hodge試驗是美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的碳青霉烯酶表型檢測方法，有研究結果顯示，改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶的敏感度為100%，特異度為79%，陽性預測值為70%，陰性預測值為100%，準確率為86%[5]。另外，也有研究表明，改良Hodge試驗常用來證實是否產KPC，其靈敏度和特異度均為100%[6]。對于本研究的151株肺炎克雷伯菌中，改良Hodge試驗陽性菌有12株，但最終經PCR確證為產碳青霉烯酶的菌株只有5株，并且其中1株經雙紙片協同試驗和組合紙片法篩選金屬酶時，兩個試驗同時為陽性且為IMP-4型，其他菌株以上3個試驗均為陰性。由以上數據可推測改良Hodge試驗篩選產碳青霉烯酶的耐藥株存在一定的假陽性，又或者由于碳青霉烯酶種類很多[3]，PCR擴增是未能完全涵蓋，未能完全排除其他未檢測到的碳青霉烯酶引起耐藥機制存在。另外，當酶的量極少時也可以造成結果的假陰性，易造成漏檢。

對產碳青霉烯酶菌株引起的感染治療起來比較困難，需要根據藥敏結果綜合分析選用適合的抗菌藥物。部分病例需使用多黏菌素，產酶株體外即使對碳青霉烯類抗菌藥物敏感，也不宜應用碳青霉烯類抗菌藥物[7]。還要提高耐藥株的檢出率，加強實驗室的管理。另外，還要避免院內感染的暴發流行。在防止細菌流行的同時，還必須高度重視質粒的流行，警惕耐藥基因在不同屬、種細菌之間或是同一菌種的不同生物型、血清型之間傳播。

[1]洪秀華，劉運德．臨床微生物學檢驗[M]．2版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：318-320.

[2]蘇丹虹，沈蘋，杜小幸，等.肺炎克雷伯菌及大腸埃希茵產KPC酶的檢測研究[J].中國抗生素雜志，2009,11(34)：684-687.

[3]Poirel L,Walsh TR,Cuvillier V,et al.Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2011，70(1):119-123.

[4]黃支密，糜家睿，盛以泉，等．攜帶blaKPC2型碳青霉烯酶基因泛耐藥肺炎克雷伯菌院內感染暴發的病原學分析[J]．中華流行病學雜志，2010，31(5)：559-562．

[5]楊啟文,鄭瑞,王輝,等.改良Hodge試驗檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的性能評估[J].中華檢驗醫學雜志,2010,33(12):1122-1127.

[6]Anderson KF,Lonsway DR,Rasheed JK,et al.Evaluation of methods to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae[J].J Clin Microbiol,2007,45(8):2723-2725.

[7]俞云松.細菌β-內酰胺酶檢測的臨床意義[J].中華結核和呼吸雜志,2008,31(6):475-477.

Detection and analysis of carbapenemase in multi-drug resistant Klebsiella pneumoniae

WANGPengkun,CHENDingqiang,YUHui

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To investigate the prevalence of carbapenemases in Klebsiella pneumoniae clinical isolates.Methods One hundred and fifty-one multi-drug resistant K.pneumoniae strains were collected in our hospital from January 2007 to December 2012 and the drug susceptibility results were analyzed.The carbapenemase phenotype test was used for conducting the detection.The PCR was used to detect the known carbapenemases gene.The amplification products were further sequenced to determine the genotypes.Results Among 151 strains of multi-drug resistant K.pneumoniae,12 strains possibly producing carbapenemase were screened by the modified Hodge test,in which 1 strain was positive in the metalloenzyme test.Among these 12 strains,5 strains producing carbapenemases were confirmed by PCR amplification and sequencing,the metalloenzyme positive strain was the type IMP-4 metalloenzyme and other 4 carbapenemase- producing strains were the type KPC-2.Conclusion Multi-drug resistant K.pneumoniae appears the strain producing carbapenemase in our hospital in recent years.Clinic should rational select carbapenem drugs according to the drug susceptibility test results for preventing the generation of drug-resistant strain.

Klebsiella pneumoniae; carbapenemase; multi-drug resistance; PCR

王鵬鯤，男，主管技師，主要從事臨床檢驗研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.015

A

1673-4130(2016)24-3423-03

2016-09-11

2016-10-29)