基于病人自體腫瘤細胞體外培養(yǎng)模型的個體化精準用藥

朱路，勾越陽，鄢曉君，周律，廖泉，王斌，葉春祥，馮長江，杜亞楠

1.清華大學 醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程系，北京 100084；2.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.北京協(xié)和醫(yī)院 外科，北京 100032；4.北京大學人民醫(yī)院 a.骨關(guān)節(jié)科；b.胃腸外科；c.胸外科，北京 100044

基于病人自體腫瘤細胞體外培養(yǎng)模型的個體化精準用藥

朱路1，2，勾越陽1，鄢曉君1，周律1，廖泉3，王斌4a，葉春祥4b，馮長江4c，杜亞楠1

1.清華大學 醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程系，北京 100084；2.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.北京協(xié)和醫(yī)院 外科，北京 100032；4.北京大學人民醫(yī)院 a.骨關(guān)節(jié)科；b.胃腸外科；c.胸外科，北京 100044

精準醫(yī)療概念的提出為腫瘤治療開創(chuàng)了新的時代。利用基因測序技術(shù)精準地找到患者基因突變靶標，采取針對性的化療藥物治療，對癌細胞完成“精確打擊”成為腫瘤治療的新模式。然而，由于癌細胞基因的不穩(wěn)定性，僅僅采用基因測序這種間接方式，在大多數(shù)情況下并不足以給出最合理的用藥方案。而精準醫(yī)療不僅僅是基因測序，還包括了多層面醫(yī)療技術(shù)的使用。利用病人自體腫瘤細胞體外模型對候選藥物或藥物組合進行精確的藥理分析和藥效檢測，是一種更為直接、更為準確的腫瘤診治模式。將基因篩選與體外腫瘤模型分析相結(jié)合，可以更大程度上的篩選出對病人個體有效的化療藥物，從而最終實現(xiàn)對患者進行個體化精準用藥的目的。本文對基于病人自體腫瘤細胞體外模型指導個性化用藥的發(fā)展歷程、現(xiàn)狀及未來展望進行了綜述。

精準醫(yī)療；病人自體腫瘤細胞；藥敏檢測；三維培養(yǎng)

1 精準醫(yī)療的概念

1.1 精準醫(yī)療的背景

精準醫(yī)療需考慮患者個體化差異，其中一個發(fā)展趨勢是利用基因組、蛋白質(zhì)組學技術(shù)和醫(yī)學前沿技術(shù)，通過分析大樣本人群和特定疾病，精確地找到病因和靶點，并據(jù)此制定個性化精準治療方案。精準醫(yī)療將改變現(xiàn)有的診斷、治療模式，為醫(yī)學發(fā)展帶來一場變革[1]。目前我國正在制定“精準醫(yī)療”戰(zhàn)略規(guī)劃，這一規(guī)劃有望納入到“十三五”重大科技專項。與傳統(tǒng)群體醫(yī)療以個人經(jīng)驗為主導、片面強調(diào)標準化不同，精準醫(yī)療更注重利用患者自身的分子生物學信息，制定與病人自身病理特點相匹配的個體化診斷和治療策略。這種更為精確的個體化醫(yī)療模式在臨床實踐中顯現(xiàn)出高度的確定性、預(yù)見性和可控性，特別適用于惡性腫瘤、糖尿病等重大疾病的臨床診治。通過整合各類組學技術(shù)和生物信息與大數(shù)據(jù)科學的交叉應(yīng)用，精準醫(yī)療可以更有針對性的對特定患者的特定疾病進行個性化治療。人們普遍相信這種新型醫(yī)療模式必將開創(chuàng)一個新的醫(yī)學時代[2]。

1.2 精準醫(yī)療用于腫瘤治療

癌癥是當今危害人類健康的主要疾病。在中國，癌癥發(fā)生率正處于快速上升期并已成為第一死因。癌癥本質(zhì)上與基因突變息息相關(guān)，而這一基因變異過程的發(fā)生和演變通常是動態(tài)的，且存在高度異質(zhì)性。不同的疾病進展階段以及不同的腫瘤細胞可能攜帶不同的變異信息，從而對以大規(guī)模人群為基礎(chǔ)開發(fā)和測試藥物的治療模式造成了嚴峻挑戰(zhàn)[3]。由于新一代測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們已經(jīng)能夠快速、高分辨率地分析基因組，通過高通量測序方法獲得腫瘤基因突變、拷貝數(shù)變異、基因移位和融合基因等海量基因變異信息；然后從海量的組學數(shù)據(jù)中解碼和提煉相關(guān)變異信息，提取起決定性作用的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，從而在成千上萬的基因突變位點中，找到真正引發(fā)癌變的關(guān)鍵基因。再以大數(shù)據(jù)分析結(jié)果作為依據(jù)，制定因人因病而異的治療方案[4]。然而，由于腫瘤的異質(zhì)性，同一腫瘤患者不同癌細胞的基因突變并不一定相同，不同關(guān)鍵基因突變的隨機組合，導致癌癥治療難度大為增加；更為嚴重的是癌癥細胞周期檢查點已破壞，各種新突變及融合基因仍在不斷累積，這些新突變及融合基因可能會破壞這些靶向藥物的靶點及其下游信號，從而使靶向治療藥物失效。因此，看似已抑制了關(guān)鍵基因，但癌癥細胞又建立新的關(guān)鍵基因并產(chǎn)生旁路，導致費盡心思尋找到的藥物在幾個月時間內(nèi)產(chǎn)生抗藥性而失效[5]。從臨床實踐來看，由基因（生物標記）檢測及診斷并通過統(tǒng)計/數(shù)學信息模型、生物大數(shù)據(jù)分析提煉的方法選擇治療方案仍處于發(fā)展階段，在可靠性和重復性方面還具有相當大的挑戰(zhàn)，導致目前完全依賴于這種間接性精準醫(yī)療方案在臨床應(yīng)用上仍有局限性。

1.3 基因組精準篩查與自體腫瘤細胞體外檢測聯(lián)合使用

為了彌補基因組精準篩查技術(shù)在可靠性和重復性方面的不足，人們開始嘗試將病人自體腫瘤細胞的體外藥敏檢測技術(shù)引入到精準醫(yī)療方案中。杭渤等[5]等報道的癌癥醫(yī)療中的個體化用藥方案，見圖1，通過在體外構(gòu)造與病人腫瘤細胞相適應(yīng)的生長微環(huán)境，使其在體外迅速適應(yīng)并快速增殖，再根據(jù)基因組精準篩查遴選出的用藥方案，直接觀察抗癌藥物或藥物組合對病人自體癌細胞的反應(yīng)，從而在臨床用藥前對基因組篩查確定的用藥方案進行驗證和擴展，為病人提供更為安全、可靠的個體化精準用藥方案。特別是使用體外三維組織或類器官作為抗癌藥物的篩選和驗證模型已越來越多的受到人們的重視[5]。

圖1 癌癥醫(yī)療中的個體化用藥方案[5]

2 基于自體腫瘤細胞體外培養(yǎng)模型的藥敏測試技術(shù)介紹及分類

2.1 技術(shù)介紹

雖然自體腫瘤細胞體外培養(yǎng)模型千差萬別，但其基本的實驗思路是十分相似的。首先在手術(shù)切割或者活檢過程中得到臨床病人的腫瘤組織樣本，然后通過物理與酶消化的方式獲得所需的腫瘤細胞或微組織，在體外進行大規(guī)模培養(yǎng)。當其生長到足夠的細胞數(shù)量時，分裝到高通量的孔板中，用已有的抗癌藥物庫進行藥物篩查，通過細胞活性和生物標志物表達的檢測，確定有效的藥物，并最終指導病人的用藥[6]。

2.2 按腫瘤組織處理結(jié)果分類

2.2.1 單細胞

通過以酶消化為主、物理消化為輔的方式將腫瘤組織分離出單細胞懸液，在單細胞懸液中加測試藥物進行培養(yǎng)，以觀察克隆形成、MTT、MTS顏色、ATP熒光值、放射性摻入變化等不同檢測終點，評價腫瘤細胞對藥物的敏感性。其中最常用的方法是MTT、MTS、ATP法。該類方法一般來說具有檢測方法簡單、無需特殊設(shè)備、便于開展、實驗時間短等特點。但成功率低、指導臨床選擇化療藥物/方案與臨床結(jié)果符合率低、可靠性差。這是因為原代細胞分離成單細胞后，不容易培養(yǎng)生長，大多數(shù)情況下加或不加藥物細胞均會因無法貼壁生長而凋亡。這可能是長期以來臨床醫(yī)生未能接受藥敏指導化療的主要原因之一。

另外，該類方法未能模擬體內(nèi)微環(huán)境，不能對經(jīng)肝酶代謝后產(chǎn)生抗癌作用的藥物如環(huán)磷酰胺等進行藥敏試驗。盡管檢測的手段不同，但原代細胞培養(yǎng)與擴增是該類方法的瓶頸，制約著其成功率和可靠性。同時分離后的原代細胞中不可避免地混雜有腫瘤間質(zhì)細胞如成纖維細胞（通常較腫瘤細胞更易生長）等，可能對藥敏試驗的結(jié)果有影響。

2.2.2 微組織塊

由于以上方法均須分離細胞，破壞了組織結(jié)構(gòu)的完整性，影響了腫瘤細胞之間的相互聯(lián)系，導致結(jié)果欠可靠。為此，Hoffman于20世紀90年代初建立組織塊培養(yǎng)（HistocultureDrug Response Assay，HDRA）方法。該法是將腫瘤組織以組織塊的形式在膠原上進行培養(yǎng)，然后加入化療藥物，觀察組織塊對化療藥物的敏感性。其特點是保持細胞間接觸，維持了組織形態(tài)和功能，更加接近機體實體瘤內(nèi)環(huán)境，臨床效果相關(guān)性好，非常適用于臨床應(yīng)用。研究表明，HDRA法可有效指導臨床化療用藥，提高多種腫瘤的臨床療效，例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、骨肉瘤、頭頸部鱗癌等。Tanahashi等報道了70例肺癌患者用HDRA法檢測藥敏，其中16例III期肺癌患者接受了誘導化療，39例III期肺癌患者接受了輔助化療，均按照兩種敏感藥物化療、一種敏感藥物化療、不敏感藥物化療分成3組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于采用誘導化療者，3組的有效率分別為100%、50%和0%，兩種敏感藥物化療組的3年存活率高于后兩組。對于采用輔助化療者，兩種敏感藥物化療組具有更高的存活率（P=0.03），提示HDRA指導的化療有助于提高臨床療效和生存時間。

中山大學符立梧、梁永鉅等對此方法進行了改良，已成功建立了一種微小組織塊培養(yǎng)-MTT終點染色-計算機圖像分析體外藥物敏感性試驗法。該方法采用體外腫瘤組織塊培養(yǎng)，通過分析給藥前和給藥后腫瘤組織的面積及顏色變化，獲得多種單藥或聯(lián)合用藥以及不同藥物濃度下的腫瘤生長抑制率。目前已用此法檢測肝癌、卵巢癌、胃癌、頭頸部腫瘤等實體瘤數(shù)百例，取得良好的效果，其檢測結(jié)果總符合率達85.7%。該法是目前較理想的腫瘤藥敏試驗方法，具有方法模擬體內(nèi)微環(huán)境、穩(wěn)定、重復性好、標本需要量少、實驗耗時短（5 d）、可評價率高、結(jié)果直觀可靠等優(yōu)點，將被廣泛應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外許多學者對腫瘤患者的外周血白細胞（Peripheral Blood Leucocyte，PBL）和腫瘤細胞這兩者對各種化療藥物敏感性的相關(guān)性進行了大量的研究，結(jié)果顯示多種腫瘤患者的PBL與腫瘤細胞體外藥敏檢測具有較好的相關(guān)性，而且腫瘤患者的PBL和腫瘤細胞一樣，對不同的藥物敏感性不一樣，都具有個體差異[7]。因此，對于在臨床上對無法取到腫瘤標本進行藥敏檢測的患者，可考慮取外周血淋巴細胞代替，這樣可提高藥敏試驗的臨床適用性，但仍需廣泛驗證。藥物基因組學與藥敏試驗相結(jié)合在指導腫瘤化療方面也取得了明顯的效果，如結(jié)腸癌患者胸苷合成酶（TS）基因多態(tài)性與5-Fu的療效相關(guān)，研究表明TYMS*2/*2或TYMS*2/*3型的患者比TYMS*3/*3型對5-Fu的敏感性更高且毒副作用更小。Chang等[8]的最新研究發(fā)現(xiàn)，MDR1 SNPs與紫杉醇的藥效相關(guān)：與MDR1 3435 CC基因型相比，3435 CT預(yù)示著接受單一紫杉醇治療的晚期乳腺癌患者的總體生存率更短。表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制藥吉非替尼在治療非小細胞肺癌研究中也發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織EGFR突變預(yù)示著吉非替尼治療有效，無突變者敏感性顯著降低。這些研究提示，腫瘤藥敏試驗與患者的遺傳背景相結(jié)合應(yīng)用于臨床腫瘤治療，對提高個體化治療效果和降低毒副反應(yīng)的發(fā)生具有重要意義。

2.3 按腫瘤模型培養(yǎng)方式分類

2.3.1 二維平面培養(yǎng)與三維立體培養(yǎng)

二維平面培養(yǎng)是目前體外構(gòu)建腫瘤模型的常用方法，利用這種體外模型人們可以對腫瘤的生長、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及藥物反應(yīng)進行分析。二維單層細胞培養(yǎng)與三維生物材料培養(yǎng)比較，見圖2[9]。作為一種過度簡單化并嚴重脫離機體生物學系統(tǒng)的培養(yǎng)方式，二維培養(yǎng)體系缺乏真實腫瘤組織的三維微環(huán)境，如缺少細胞外基質(zhì)的支持貼壁，生長的細胞失去了原有形態(tài)特征及生長分化的能力，缺乏三維立體構(gòu)型以研究細胞與細胞、細胞與微環(huán)境之間的相互作用，尤其在研究惡性腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移方面存在嚴重的局限性，導致其在抗腫瘤藥物篩選和檢測中經(jīng)常造成假陽性[9]。

圖2 二維單層細胞培養(yǎng)與三維生物材料培養(yǎng)比較[9]

體外細胞培養(yǎng)的一個重要原則就是模擬體內(nèi)細胞生長的環(huán)境。相對于二維扁平化培養(yǎng)的細胞模型，三維立體環(huán)境下培養(yǎng)的細胞在骨架形態(tài)、分化水平、遷移能力以及細胞之間相互作用和信號轉(zhuǎn)導機制等方面更加接近于體內(nèi)真實情況。因此在這種微環(huán)境下生長的腫瘤模型其藥物反應(yīng)、抗藥性程度以及藥物滲透水平與體內(nèi)較為接近，從而可更加準確地反映候選藥物或藥物組合的效果。已有相關(guān)文獻對此進行了研究，例如乳腺癌細胞系MCF7在二維培養(yǎng)時以及在基于殼聚糖的三維支架時，在細胞增長數(shù)目、葡萄糖的消耗量以及代謝產(chǎn)物乳酸量上都表現(xiàn)出了明顯的不同。在初始葡萄糖濃度相同的情況下，三維培養(yǎng)時MCF7在快速增長階段消耗的葡萄糖要快，細胞數(shù)目較多；在環(huán)境中葡萄糖趨于耗盡時，三維培養(yǎng)的MCF7明顯比二維培養(yǎng)的MCF7數(shù)量要多，在這個過程中，三維培養(yǎng)的MCF7所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸量也比二維培養(yǎng)所產(chǎn)生的乳酸量逐漸增多[10]。2.3.2 癌細胞單獨培養(yǎng)與間質(zhì)細胞共培養(yǎng)

腫瘤微環(huán)境除了具備三維空間結(jié)構(gòu)，還包含有多種間質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）。近年來的研究表明，腫瘤的發(fā)展惡化不僅僅與腫瘤細胞的自分泌有關(guān)，而且受周圍細胞及基質(zhì)的影響很大，與腫瘤細胞共同組成一個系統(tǒng)完備的微環(huán)境。這些細胞包括成纖維細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及血管內(nèi)皮細胞等。腫瘤細胞與間質(zhì)細胞以及細胞外基質(zhì)的相互作用不僅可以影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，同時也會顯著影響腫瘤對藥物的敏感性和耐受性。這種腫瘤微環(huán)境的形成增強了腫瘤對外界的抵抗力，特別是對藥物治療作用的抵抗，導致抗腫瘤藥物的實際藥效常常與單細胞腫瘤模型的預(yù)測結(jié)果不符。

在眾多的間質(zhì)細胞當中，所占比例最高的是成纖維細胞。這類細胞在一些因素的刺激下被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細胞（TAFs）。這類活化的TAFs能夠誘發(fā)腫瘤形成，促進腫瘤生長，在某些類型的癌細胞中還會誘導發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal Transformation，EMT）。另一種起重要作用的間質(zhì)細胞是巨噬細胞，這種細胞起源于外周血中的單核/巨噬細胞，在不同刺激條件下，單核細胞可以分化為促進腫瘤發(fā)展的M2型巨噬細胞。外周血中的單核/巨噬細胞被腫瘤微環(huán)境中的趨化因子和細胞因子募集到腫瘤微環(huán)境后，誘導分化成腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）。這種TAMs表現(xiàn)出促進腫瘤轉(zhuǎn)移和生長的作用，并且其浸潤程度與惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤中高密度的TAMs浸潤是患者生存率降低的指標之一。腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)皮細胞是腫瘤血管生成的基礎(chǔ)，新生血管既為腫瘤生長提供營養(yǎng)和氧氣，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要途徑。內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞相互作用導致兩者粘附分子上調(diào)、肌動球蛋白骨架重組，以及鈣粘蛋白的表達變化。內(nèi)皮細胞還可以通過分泌某些血管生長因子和趨化因子誘導腫瘤細胞產(chǎn)生促炎因子，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲、增加收縮力和重塑細胞骨架[11]。

2.3.3 體外直接培養(yǎng)與異種移植培養(yǎng)

除了直接將病人自體腫瘤細胞在體外培養(yǎng)并檢測外，還有另一類被廣泛采用的個體化藥敏檢測手段，即病人源性異種移植培養(yǎng)（Patient-derired Xenograft，PDX），它是將病人的臨床腫瘤組織轉(zhuǎn)移到裸鼠中建立動物模型并進行后續(xù)檢測。美國西北醫(yī)院強文安教授對其進行了深入研究并將這種方法用于藥物開發(fā)與腫瘤治療中。這種培養(yǎng)方法的優(yōu)勢是可以利用異種動物的相同組織環(huán)境最大限度的模擬人體實驗環(huán)境（例如將卵巢癌組織接種于裸鼠卵巢膜下），再通過裸鼠體內(nèi)微環(huán)境實現(xiàn)人源腫瘤細胞的擴大培養(yǎng)并用于藥敏檢測。雖然這種方法可以構(gòu)造出極為復雜的腫瘤微環(huán)境，并且這種微環(huán)境很難在體外通過人工方式重建出來的，理論上來說實驗結(jié)果應(yīng)該更具代表性。然而從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，結(jié)果并非如此。細胞在體成瘤后（實驗動物）的藥敏結(jié)果并不等同于藥物對患者有效，致使不少臨床前有較好藥效的藥物在臨床階段被淘汰。另外這種方法技術(shù)難度較大、成本昂貴、實驗周期長、缺少重要的免疫影響因素，并且很難實現(xiàn)高通量檢測[12]。

3 領(lǐng)域現(xiàn)狀及未來發(fā)展

3.1 病人自體腫瘤細胞的個體化藥效分析和篩選技術(shù)

3.1.1 膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)（CD-DST）

原代癌細胞來源少一直制約體外細胞藥敏檢測的推廣。在此種研究背景下，人們建立了膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)（Collagen gel Droplet Culture drug-Sensitivity Test，CDDST），一種體外腫瘤藥敏檢測技術(shù)，其突出特點是能夠排除成纖維細胞對實驗的干擾，在體外對抗癌藥物的特異性殺傷作用做出客觀評價，同時所需標本量小（3×103個細胞/孔）的特點擴大了該技術(shù)的應(yīng)用范圍，彌補了目前其他藥敏檢測技術(shù)的不足。國外臨床研究表明，此技術(shù)的體外檢測結(jié)果與臨床療效間存在較好的相關(guān)性。

由于人體內(nèi)的腫瘤組織是由腫瘤細胞、正常細胞和細胞外基質(zhì)共同組成的細胞群體，腫瘤細胞生長的微環(huán)境對腫瘤細胞生長產(chǎn)生重要影響。CD-DST技術(shù)是利用膠原凝膠在37 ℃時形成三維立體結(jié)構(gòu)的特點，在體外模仿了體內(nèi)腫瘤細胞生長的微環(huán)境，使腫瘤細胞能夠在與體內(nèi)環(huán)境相似的條件下生長，生長的腫瘤細胞具有與體內(nèi)相似的細胞形態(tài)特點。經(jīng)過7 d的培養(yǎng)后，經(jīng)干膠、染色、掃描等程序最終對化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用程度做出客觀評價。

CD-DST技術(shù)具有以下優(yōu)勢：① 細胞用量少，這樣不僅可對小量的組織標本進行藥物敏感性測定，而且可以對胸腹水等液體標本進行檢測，從而可以使乳腺針吸活檢標本、胸水標本、組織活檢標本進行體外藥敏檢測，擴大了腫瘤藥敏技術(shù)的檢測范圍；② 腫瘤細胞在膠原凝膠所形成的三維立體培養(yǎng)環(huán)境中，培養(yǎng)成功率高，細胞具有與體內(nèi)細胞相似的生長形態(tài)；③ 本技術(shù)培養(yǎng)的細胞可以采用圖像軟件系統(tǒng)分析結(jié)果，可排除成纖維細胞對實驗的干擾，可對抗癌藥物對腫瘤細胞的特異性殺傷作用在體外做出客觀評價；④ 結(jié)果測定快速（3 s/滴），可利用計算機進行結(jié)果分析，測定6種藥物的時間只需1 min。

3.1.2 組織培養(yǎng)藥敏檢測技術(shù)（HDRA）

Hoffman于20世紀90年代初建立HDRA法[13]，此方法已在2.2.2章節(jié)中進行了敘述。

3.1.3 人腫瘤細胞原代裸鼠移植瘤模型法

為了模擬體內(nèi)環(huán)境，人們將腫瘤組織塊接種于裸鼠的皮下或腎包膜下，建立裸鼠移植瘤模型。由于裸鼠缺乏T淋巴細胞，異種移植時排斥反應(yīng)不明顯，進行人腫瘤移植時，可保持原有的生物學特性及對抗癌藥物的敏感性，也可評估經(jīng)代謝后起作用的藥物敏感性，是進行腫瘤藥敏試驗的良好模型。1969年，Rygarrd和Povlsen等首次將人結(jié)腸癌細胞植入裸鼠皮下獲得成功，之后許多研究者采用裸鼠皮下移植法研究人胃癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤對抗癌藥物的敏感性，證實當給予荷瘤裸鼠有效藥物時，移植物的化療敏感性可從本質(zhì)上反映腫瘤患者的化療敏感性。Fiebig等報道了用此法指導36例實體瘤患者的化療，結(jié)果顯示裸鼠移植瘤法對抗癌藥耐藥性預(yù)測的準確率達97%，敏感性達92%。但該方法移植成功率低，同時操作復雜、要求無特定病原（Specifc Pathogen Free，SPF）級的動物實驗室、移植瘤生長慢、實驗耗時長（30～40 d）、費用昂貴等，不適合作為常規(guī)用于臨床藥敏試驗的手段。

3.2 技術(shù)在國內(nèi)外醫(yī)療體系中的發(fā)展現(xiàn)狀

現(xiàn)階段國內(nèi)外已有多家醫(yī)療單位將病人自體腫瘤細胞的體外藥敏分析作為常規(guī)診療服務(wù)項目。如日本早在2008年就由中央社會保險醫(yī)療協(xié)會發(fā)布了《對現(xiàn)有醫(yī)療保險引入的先進醫(yī)療技術(shù)》，將病人自體腫瘤細胞的體外抗癌藥敏感性試驗（主要是CD-DST方法）列入“被評定為適合優(yōu)先引進醫(yī)療保險的現(xiàn)今醫(yī)療”。這一協(xié)會在另一份文件《根據(jù)新聯(lián)合實施的先進醫(yī)療專家會議的第二項先進醫(yī)療科學評價結(jié)果》中，將CD-DST法的抗惡性腫瘤藥敏實驗總評結(jié)果設(shè)為“適用”。適應(yīng)癥包括胃腸癌（除治愈級別C的胃癌）、頭頸部癌、乳腺癌、肺癌、乳腹膜炎、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌或卵巢癌。國內(nèi)方面，上海也早在2008年就為癌癥患者提供基于先進腫瘤藥敏檢測的個體化化療方法。醫(yī)生可通過一張“腫瘤藥敏報告單”為病人制定更加合理的化療方案。江蘇省也已經(jīng)將腫瘤細胞化療藥物敏感試驗（HDRA檢測）納入“江蘇省基本醫(yī)療保險和工商保險診療服務(wù)項目、醫(yī)療服務(wù)設(shè)施范圍和支付標準”。南京鼓樓醫(yī)院腫瘤中心已經(jīng)利用新鮮腫瘤組織三維培養(yǎng)藥敏檢測平臺（HDRA）來指導藥物選擇。天津市于2013年頒布的《天津市基本醫(yī)療保險和生育保險診療項目暨醫(yī)療服務(wù)設(shè)施標準》中，將人體腫瘤SKC法藥敏測定納入醫(yī)保范圍（序號1254）。新疆省在最新公布的醫(yī)療服務(wù)價格項目中也提及了人體腫瘤SKC法藥敏測定項目。由中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會最新發(fā)布的腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》更是對病人自體腫瘤細胞體外藥敏檢測中涉及的樣本采集、分析質(zhì)控、結(jié)果報告、診斷標準等進行了一整套規(guī)范化要求，為腫瘤治療的精準化用藥提供了重要保證。

3.3 存在的問題

3.3.1 細胞來源稀缺降低藥敏檢測通量

癌癥藥敏檢測需要大量的癌細胞來源，而在手術(shù)過程中，腫瘤細胞并不能滿足大量的藥敏檢測需要。同時，由于原代細胞分離技術(shù)的不完善，導致細胞獲取的機會大大降低，嚴重影響了癌癥組織體外藥敏檢測模型的大面積推廣。

3.3.2 藥敏檢測技術(shù)的時效性

從應(yīng)用角度講，藥敏檢測結(jié)果應(yīng)在病人需要進行化療之前得出，以幫助病人指導用藥。但現(xiàn)有原代細胞培養(yǎng)的技術(shù)并不完善，導致研究人員很難在短時間內(nèi)得到大量的樣本進行藥敏檢測。尤其對于一些病情惡化的患者，并沒有過多的時間來等待檢測結(jié)果。所以，如何能快速得到藥敏測試結(jié)果也將是研究人員需要考慮的問題之一。

3.3.3 檢測技術(shù)對體內(nèi)的模擬程度

目前對于什么手段能夠更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境仍然存在較大爭議。但是作為腫瘤細胞體外培養(yǎng)模型，將來的應(yīng)用方向是指導病人的用藥與進行新藥的開發(fā)，因此檢驗體外腫瘤培養(yǎng)模型是否能夠準確有效地預(yù)測藥物對體內(nèi)腫瘤的殺傷效果是本領(lǐng)域的核心問題。而目前在這方面的研究還很薄弱，主要受限于原代細胞的分離、培養(yǎng)技術(shù)手段不成熟、實驗周期長、體外體內(nèi)藥效較難比較等原因。但如果要將體外腫瘤模型推向醫(yī)療應(yīng)用，這一系列難題需要被一一攻克。

3.4 展望

3.4.1 病人自體腫瘤細胞快速擴增技術(shù)的發(fā)展

癌癥藥敏檢測需要大量的癌細胞來源，而手術(shù)獲得的腫瘤細胞并不能滿足高通量藥敏檢測的需求。所以，高通量癌癥藥敏檢測需要在體外對癌細胞進行快速擴增，以達到所需的細胞量。而來自于病人的原代細胞并不容易適應(yīng)體外環(huán)境，細胞存活、擴增都存在較大問題。研究人員通過在原代腫瘤細胞中加入不能分裂的成纖維細胞，調(diào)節(jié)癌細胞生長的微環(huán)境，使其擁有與體內(nèi)更高的相似性，以期待最終癌細胞可以在體外存活并快速擴增。Liu等[14]通過對原代腫瘤細胞與無分裂能力的成纖維細胞共培養(yǎng)，并添加ROCK抑制因子的方式，來促進癌細胞以較快的速度生長，從而在短時間內(nèi)擴增大量癌細胞。基于這種癌細胞快速擴增技術(shù)，Crystal等[15]開發(fā)出了能夠快速確定當腫瘤產(chǎn)生單一藥物抗藥性后所應(yīng)采用的聯(lián)合用藥方案。通過快速擴增技術(shù)得到大量病人源性腫瘤細胞的應(yīng)用實例，見圖3[15]。相較于通過單純遺傳分析的手段來尋找新的藥物靶點，直接進行細胞毒性檢測得到的結(jié)果更為直接，同時有助于發(fā)現(xiàn)新的有效藥物。

3.4.2 體外3D腫瘤組織類器官藥物篩選模型的優(yōu)化

由于3D細胞培養(yǎng)規(guī)范化的模式尚未建立，因此需要優(yōu)化現(xiàn)有系統(tǒng)以產(chǎn)生穩(wěn)定可重復的檢測結(jié)果。例如，通過引入細胞外基質(zhì)材料來模擬體內(nèi)環(huán)境可能會由于基質(zhì)材料批次間的差異造成結(jié)果不穩(wěn)定。因此實驗前要注意檢測其所含成分的差異。3D細胞培養(yǎng)所模擬的狀態(tài)通常歷時較短，然而在體內(nèi)腫瘤的生成是長時間進程。驗證體內(nèi)腫瘤和體外模型的形成時間差異是否會對結(jié)果造成影響也是一個很關(guān)鍵的問題。在3D細胞培養(yǎng)中，細胞密度大，對營養(yǎng)的需求也會更高，但在3D培養(yǎng)條件中，這一需求并不能完全得到滿足。和傳統(tǒng)的2D平面培養(yǎng)細胞相比，單個細胞氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)匱乏，影響細胞培養(yǎng)狀態(tài)，可能致使實驗重復性不佳，降低了3D模型的穩(wěn)定性。3D體外模型缺乏復雜的脈管系統(tǒng)，而體內(nèi)這些脈管系統(tǒng)通過簡單擴散可以為組織提供氧、營養(yǎng)，并清除廢物。所以在一個3D腫瘤組織體外模型進行表征時，也應(yīng)當對系統(tǒng)內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和廢物的擴散能力進行表征。

3.4.3 在國內(nèi)醫(yī)療體系中的發(fā)展趨勢

隨著對惡性腫瘤認識的不斷深入，人們已經(jīng)迫切的感受到精準醫(yī)療對于腫瘤診治的重要性。盡管基于基因篩查的腫瘤精準醫(yī)療技術(shù)突飛猛進并受到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，但基于病人自體腫瘤細胞的藥敏篩查技術(shù)仍處于發(fā)展階段，受到的重視程度依然不足。然而，現(xiàn)階段制約自體腫瘤藥敏篩查的幾個主要因素，如原代細胞稀缺、檢測周期相對較長、體外模擬程度較低等問題均已取得重大突破。特別是體外三維培養(yǎng)腫瘤微組織模型的飛速發(fā)展更是極大的促進了藥敏檢測的準確性和有效性。我們有理由相信，在不久的將來，體外三維培養(yǎng)腫瘤微組織能夠與基因篩查互為驗證和補充，共同實現(xiàn)精準醫(yī)療的目標。

圖3 通過快速擴增技術(shù)得到大量病人源性腫瘤細胞的應(yīng)用實例[15]

致謝

本實驗室的研究工作受到了國家自然科學基金（81171474、51273106、51461165302）和北京市自然科學基金（157142090）的支持。

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Precise Medicine in Cancer Treatment via Patient Derived in Vitro Tumor Model

ZHU Lu1,2, GOU Yue-yang1, YAN Xiao-jun1, ZHOU Lv1, LIAO Quan3, WANG Bin4a, YE Chun-xiang4b, FENG Chang-jiang4c, DU Ya-nan1
1. Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China; 3.Department of Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100032, China; 4.a. Department of Arthritis; b. Department of Gastroenterological Surgery; c. Department of Thoracic Surgery, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China

The concept of precise medicine opens a new gate for cancer treatment. Nowadays, gene mutations possibly responsible for chemotherapeutic sensitivity can be pinpointed based on the Whole Genome Sequencing (WGS) technology to attack the tumor targeting to specific mutation. However, gene sequencing probably is not capable of providing the most suitable drug usage solution due to tumor genetic instability. In addition to the WGS, precise medicine also includes drug sensitivity testing. Chemo-sensitivity drug testing with patient derived primary tumorin vitromodel can provide more direct and accurate medical indication compared with the WGS because critical information for drug usage, such as pharmacological analysis and drug efficiency, can be acquired simply. The combination of genetic analysis andin vitromodel screening is helpful to fnd the most promising drug or drug combination for each patient and thus achieves the personalized medicine and increases tumor treatment effciency. This paper discussed the history, status, perspectives of current method of patient derived tumorin vitromodel.

precise medicine; patient derived tumor cells; drug sensitivity testing; 3D cell culture

R318

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.06.003

1674-1633(2016)06-0013-06

2015-10-30

2015-12-21

國家自然科學基金（81171474、51273106、51461165302），北京市自然科學基金（157142090）。

杜亞楠，教授。

通訊作者郵箱：duyanan@tsinghua.edu.cn