CD73在卵巢上皮性癌組織中的表達及與腫瘤生長轉移的相關性研究

馬思宇，王瑛韜，狄 娜，王瑛堅*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033;2.吉林大學中日聯誼醫院 藥劑科)

CD73在卵巢上皮性癌組織中的表達及與腫瘤生長轉移的相關性研究

馬思宇1，王瑛韜2，狄 娜1，王瑛堅1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033;2.吉林大學中日聯誼醫院 藥劑科)

目的 檢測卵巢上皮性癌中CD73的表達情況及微血管計數值，探討CD73與卵巢上皮性癌發生、發展、轉移的關系。方法 利用免疫組化法及微血管計數法，檢測正常卵巢組織，卵巢上皮性囊腺瘤，卵巢交界性上皮性囊腺瘤，卵巢上皮性囊腺癌中CD73的表達情況及微血管計數。分析卵巢上皮性癌中CD73表達程度及MVD計數與臨床病理學參數的關系，并分析二者之間的關系。結果 卵巢上皮性癌組織中CD73的表達程度及MVD計數均高于良性組及交界組(P<0.05)，二者與患者年齡、組織學分型無關，與臨床分期、組織學分級、淋巴結浸潤、腹水及腹腔沖洗液中癌細胞相關，并且二者之間的表達正相關。結論 CD73在腫瘤的發生機制中起到一定的作用；CD73與惡性腫瘤嚴重程度正相關，有望作為一個新的評估卵巢上皮性癌病情進展及預后的指標，為基因的靶向治療提供了新的思路。

卵巢上皮性癌；CD73；免疫組化；微血管密度

(ChinJLabDiagn,2016,20:2037)

CD73是一種跨膜糖蛋白，在生物體內參與胞外腺苷酸轉化為腺苷的生物學過程，并且在這一過程中起到關鍵酶的作用[1]。近期研究發現，CD73在多種惡性腫瘤中高表達，在惡性腫瘤的形成、侵襲、轉移中起重要作用。腫瘤能夠在其轉移部位的成功生長，有賴于腫瘤新生血管的供應作用。體外實驗證實，微血管密度(MVD)是腫瘤樣血管增生的定量指標，有報道指出在一些腫瘤中，MVD計數升高與腫瘤較差的預后存在著聯系[2]。本實驗旨在利用檢測CD73的表達情況及MVD計數，探討CD73在卵巢上皮性癌發生、發展中的作用機制，為卵巢上皮性癌的惡性程度的評價及預后評估提供一定的參考依據，以及能否通過抑制CD73的表達，為未來的基因靶向治療提供一定的理論依據及新的靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取吉林大學中日聯誼醫院和長春市醫院2014年1月至2015年12月間手術切除的組織標本，其中因其它疾病切除的正常卵巢組織20例、卵巢良性上皮性腫瘤組織20例、卵巢交界性上皮性腫瘤39例和卵巢上皮性癌組織84例。所有患者術前均未行放療、化療和激素治療，亦未合并其他系統惡性腫瘤?；颊吣挲g在32-77歲之間，平均年齡46.2±6.5歲；臨床分期(FIGO.2013)，I-II期34例，III-IV期50例；組織學分級，G1 19例，G2 26例，G3 39例；組織學分型，漿液性58例，粘液性26例；有淋巴結轉移者30例，無轉移者54例；有36例患者的腹水或腹腔沖洗液中有癌細胞，48例未發現。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑 CD73(Mouse CD73 antibody)免疫組化染色試劑盒(艾博抗上海)；CD34(Mouse anti-CD34)免疫組化染色試劑組盒(北京中杉金橋)。

1.2.2 方法 所有選取標本均為新鮮取材，并立即于10%中性福爾馬林溶液中固定，完成后經石蠟包埋、切片、免疫組化染色、HE染色。以試劑盒內已知的陽性切片為陽性對照，檢測CD73的表達情況，同時應用CD34對腫瘤新生血管進行標記，進行微血管計數。

1.3 結果判定

1.3.1 CD73的結果判定 CD73陽性表達為：鏡下在卵巢上皮細胞及腫瘤間質細胞胞膜或胞漿內出現棕黃色顆粒。切片評分采用綜合評分法，①根據病變區域的普通染色強度記分：無著色或淡黃色，計為1分；細胞著色為棕黃色，計為2分；細胞明顯著色為棕褐色，計為3分；②根據病變區域陽性細胞所占百分比記分：隨機選取5個高倍視野，分別計數100個細胞，陽性細胞計數0%-10%為1分；10%-50%為2分；50%-100%為3分。以上兩項評分相乘積為最終綜合評分。評分1-3分判定為低表達；評分4分以上判定為高表達[3]，其中4分為強度I級，6分為強度II級，9分為強度III級。

1.3.2 MVD的判斷標準 采用CD34標記微血管。血管內皮細胞胞漿著色為棕黃色，并且孤立或成團簇出現，只要其與臨近微血管、腫瘤細胞或其它結締組織分開，就把它們作為一個微血管。根據Weidner[4]計數方法，高倍鏡下計數5個不同視野的微血管數，取平均值為間質微血管密度。單個著色的內皮細胞或者內皮細胞叢均按獨立血管計數；管腔較大且有較厚肌層或管腔內有8個以上紅細胞者，不在計數之列。

1.4 統計學方法

顯著性檢驗采用χ2檢驗進行組間比較；各組間MVD計數均數比較用t檢驗處理；CD73表達情況與MVD計數的相關性用Spearman等級相關分析進行分析。結果以P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中的CD73表達情況及MVD計數

CD73在卵巢上皮性癌中的陽性表達程度及MVD計數值明顯高于正常卵巢、良性和交界性上皮性卵巢腫瘤。提示CD73表達上調及腫瘤血管新生可能在卵巢上皮性癌的發生中起重要作用。(見表1)。

表1 在不同卵巢組織的中CD73的表達及MVD計數

注：比較CD73高表達率，正常組、良性組、交界性組3組間相互比較均無顯著性差異(P>0.05)，此3組 與惡性組比較均有顯著性差異(P<0.001)。各組間相互比較 MVD計數，P均<0.001，有統計學差異。

圖1 CD73腫瘤上皮細胞典型及異質性染色 雙盲評分4分(SP×400)高表達Ⅰ級 圖2 CD73腫瘤上皮細胞膜典型著色雙盲評分6分(SP×400)高表達Ⅱ級 圖3 CD73腫瘤上皮細胞膜典型著色雙盲評分9分(SP×400) 高表達Ⅲ級

2.2 卵巢上皮性癌組織中CD73的表達情況、MVD計數與臨床病理學參數的關系

CD73陽性表達程度與MVD計數值與卵巢上皮性癌的多種病理學參數呈正向關系，臨床分期越晚、組織分化程度越低、有淋巴結轉移、腹水及腹腔沖洗液中有癌細胞者，CD73的陽性表達程度及MVD計數值越高。兩者均與卵巢上皮性癌患者的年齡及病理學類型無關。(見表2)

表2 CD73陽性表達程度、MVD計數與臨床病理學參數關系

2.3 卵巢上皮性癌組織中CD73的陽性表達情況與MVD計數的關系

在卵巢上皮性癌患者中，MVD與CD73的表達程度呈正相關(r=0.914，P<0.001)。(見表3)

表3 卵巢上皮性癌組織中CD73的陽性表達情況與MVD計數的關系

注：r=0.914，P<0.001

3 討論

卵巢癌是女性最常見的致死性女性惡性生殖系統腫瘤之一，患者的5年生存率較低。隨著近年來精準醫學概念的提出，尋找基因水平的靶向治療已成為研究的熱點。CD73，又稱胞外-5’-核苷酸酶，參與細胞的分子信號轉導，發揮多種生物學作用[1]。CD73是具有酶活性的核苷酸，能夠催化腺苷酸水解成為腺苷。生理狀態下，小劑量的腺苷具有抑制細胞生長，誘導細胞凋亡的作用。近年研究發現CD73在多種惡性腫瘤中高表達，在惡性腫瘤的形成、侵襲、轉移中起重要作用。腫瘤新生血管的形成對于腫瘤的新生、轉移至關重要。MVD是腫瘤樣血管增生的定量指標，有報道指出在一些腫瘤中，高表達的MVD與腫瘤較差的預后存在著聯系。CD34能夠在未成熟及內皮腔細胞內表達，標記腫瘤新生血管，CD34較其他因子具有更高的特異性及敏感性，是最有效指標[2]。

本研究發現，卵巢上皮性癌組織中CD73的表達程度及MVD計數均高于良性組及交界組(P<0.05)，二者與患者年齡、組織學分型無關，與臨床分期、組織學分級、淋巴結浸潤、腹水及腹腔沖洗液中癌細胞相關，并且二者之間的表達正相關。研究表明卵巢上皮性癌組織內普遍缺氧，而當組織處于缺血、缺氧的病理狀態時，CD73表達上調[5]，導致腺苷生成增多，可以誘導癌細胞釋放高水平的血管生成誘導因子，這些因子的增多可促進腫瘤血管的新生，誘導腫瘤的生長。還可以增加細胞的遷移、增殖和管腔形成的能力，有潛在的促進血管生成的作用。同時可以增加血管生成因子的旁分泌作用，直接作用于血管內皮細胞，誘導腫瘤血管的新生[6]。另外，CD73的酶活性可直接上調多種血管生成因子的表達，下調多種血管生成抑制因子的表達，破壞二者之間的平衡狀態，直接促進腫瘤血管的新生。CD73同時具有非酶活性，可以直接參與影響炎癥細胞與內皮細胞的黏附作用，淋巴細胞的轉導過程，發揮促進免疫逃逸、免疫抑制的病理學功能。阻礙了機體對于腫瘤細胞的正常免疫應答，導致腫瘤的發生[5，6]。

國內外已有多項抑制CD73在惡性腫瘤中表達的體外實驗，用CD73 單克隆抗體或多克隆抗體阻斷小鼠乳腺癌細胞CD73的功能[16]，可顯著抑制癌細胞生長及癌癥的肺轉移。腫瘤的分子靶向治療相對于普通的化學藥物治療具有更高的特異性、安全性，然而適用于臨床治療的靶向藥物少之又少，用CD73單克隆抗體或多克隆抗體技術、小干擾RNA技術來阻斷CD73表達，使其功能缺失，對于腫瘤治療至關重要，因此CD73有望成為基因治療的新靶點，為基因靶向治療提供新的思路，值得進一步研究[7]。

[1]Corbelini PF,Figueiró F,das Neves GM,et al.Insights into Ecto-5'-Nucleotidase as a New Target for Cancer Therapy:A Medicinal Chemistry Study[J].Curr Med Chem，2015 Apr 8.[Epub ahead of print]

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[7]Antonioli L,Yegutkin GG,Pacher P,et al.Anti-CD73 in cancer immunotherapy:awakening new opportunities[J].Trends Cancer,2016,2(2):95.

The expression of CD73 in epithelial ovarian tumor and relevant research of tumor growth and transfer

MASi-yu,WANGYing-tao,DINa,etal.

(China-JapanUnianHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective Researched the CD73 expresssion level and microvessel density in epithelial ovarian carcinoma tissues.And discuss the relationship between CD73 and the occurrence,development and transfer of epithelial ovarian cancer.Methods Using immunohistochemistry and microvessel counting method,detect expression of CD73 and microvessel count of normal ovarian tissues,ovarian cystadenoma,borderline ovarian cystadenoma,epithelial ovarian cystadenocarcinoma.Analysis the relationship between CD73 expression level and MVD with parameters and clinical pathology in ovarian epithelial carcinoma,and analyze the relationship between they two.Results In epithelial ovarian cancer tissues CD73 expression and MVD are higher than those in benign and borderline group (P< 0.05),independent of patients?age,histological type,but dependent of clinical stage,histological grade,lymph node metastasis and cancer cells in ascites and peritoneal flushing fluid,and CD73 expression and MVD are positively correlated.Conclusion CD73 plays a role in the pathogenesis of tumor.CD73 was positively correlated with the severity of malignancy,could be used as indicators of new assessment of disease progression and prognosis of ovarian epithelial cancer and new ideas of gene targeted therapy .

Epithelial ovarian carcinoma；CD73；Immunohistochemical stain；Microvessel density

吉林省科技發展計劃項目(編號：20140414018GH)

1007-4287(2016)12-2037-04

R737.31

A

2016-03-04)

*通訊作者