低表達miR-338-3p誘導內皮細胞EOMA炎癥反應

于淑倩,隋小芳,王鳳玲,苑露丹,劉 宇,張培培

(佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

低表達miR-338-3p誘導內皮細胞EOMA炎癥反應

于淑倩,隋小芳*,王鳳玲,苑露丹,劉 宇,張培培

(佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

目的 研究miR-338-3p在內皮細胞EOMA炎癥反應中的作用。方法 用TNF-α 20 ng/ml處理內皮細胞系EOMA 24 h，實時熒光定量PCR檢測miR-338-3p、黏附因子VCAM-1和ICAM-1 mRNA表達水平，Western blot分析ERK及p38 MAPK信號通路活性；構建miR-338-3p低表達腺病毒載體(miR-338-3p inhibitor)，感染EOMA細胞48 h，PCR檢測miR-338-3p、VCAM-1及ICAM-1 mRNA表達水平，Western blot分析ERK及p38 MAPK信號通路活性。結果 TNF-α 20 ng/ml處理EOMA細胞 24 h miR-338-3p表達水平下降，ERK及p38蛋白磷酸化水平升高，VCAM-1及ICAM-1 mRNA表達水平升高；miR-338-3p inhibitor 感染EOMA細胞48 h，miR-338-3p表達水平明顯降低，ERK及p38蛋白磷酸化水平明顯升高，黏附因子VCAM-1及ICAM-1 mRNA基因表達水平升高。結論 在內皮細胞EOMA炎癥模型中，TNF-α下調miR-338-3p表達水平；低表達miR-338-3p激活MAPK信號通路活性，增強黏附因子表達水平，誘導EOMA細胞炎癥反應。

miR-338-3p;內皮細胞；炎癥反應；黏附因子

(ChinJLabDiagn,2016,20:2002)

動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病[1]。研究表明，miRNA參與調控許多病理生理學機制如炎癥炎介質產生、細胞黏附、增殖、凋亡、脂質攝取與流出等，并參與調控炎癥信號通路活性，對動脈硬化發生發展有著重要的調節作用[2,3]。近年來有報道指出miR-338-3p與糖尿病心肌病有關[4]，并參與腫瘤細胞分化、增殖及遷徙[5]。然而miR-338-3p是否參與調節內皮細胞炎癥反應尚未見報道。因此，研究miR-338-3p在血管內皮炎癥反應中的作用及其機制，為基因靶向治療動脈硬化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

EOMA細胞(小鼠血管瘤內皮細胞珠，購于中國醫學科學院細胞庫)；H-DMEM 培養基(Invitrogen公司)；FBS胎牛血清(Hyclone公司)；TNF-α (Epitomics公司)；HRP標記的羊抗兔IgG相關抗原抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；miR-338-3p低表達腺病毒載體(AD-338-3p inhibitor)(構建與純化由上海吉凱科技有限公司完成)；SYBR Premix Ex Taq II(日本TAKARA)；Rabbit GAPDH Antibody(美國CST)；磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-ERK)抗體、ERK抗體、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶抗體及p38抗體均購于美國CST。

1.2 細胞培養

EOMA細胞用含10%胎牛血清FBS的高糖培養基H-DMEM 于37℃、5% CO2培養箱內培養。

1.3 檢測miR-338-3p在內皮損傷中的表達

將EOMA細胞接種于六孔板中，分別設為對照組和TNF-α處理組。對照組正常培養，TNF-α處理組用TNF-α 20 ng/ml處理內皮細胞24 h。收集細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄miRNA合成cDNA，用SYBR Green熒光定量試劑盒和實時熒光定量PCR儀檢測miR-338-3p表達，以U6作為內參進行比較，結果用2-ΔΔct計算相對表達量。引物設計如下：

引物名稱反轉錄引物序列5′?3′miR?338?3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT?TCGCACTGGATACGACcaacaaU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT?TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名稱PCR引物序列5′?3′miR?338?3pGCGTCCAGCATCAGTGATTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCReverseGTGCAGGGTCCGAGGT

1.4 觀察內皮損傷后黏附因子表達和MAPK信號通路變化

上述細胞逆轉錄cDNA用PCR檢測黏附因子VCAM-1和ICAM-1的表達水平。提取上述兩組細胞總蛋白，Western blot 分析ERK及p38 MAPK信號通路變化。VCAM-1和ICAM-1及內參18S的引物設計如下：

引物名稱PCR引物序列5′?3′VCAM?1ForwardCACTTGTGGAAATGTGCCCGVCAM?1ReverseTCACACTCGTATATGCCGGCICAM?1ForwardTTTTCAGCTCCGGTCCTGACICAM?1ReverseCCGCTCAGAAGAACCACCTT18sForwardGGAAGGGCACCACCAGGAGT18sReverseTGCAGCCCCGGACATCTAAG

1.5 低表達miR-338-3p對內皮細胞炎癥反應信號通路變化

構建miR-338-3p低表達腺病毒載體(338i)和陰性對照病毒(NCi)，分別感染EOMA細胞48小時。收集細胞，PCR 檢測miR-338-3p表達及黏附因子VCAM-1和ICAM-1 mRNA的表達變化，Western blot分析ERK及p38 磷酸化水平。

1.6 統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件，采用t檢驗和單因素方差分析進行數據處理，以GraphPad Prism 5.0軟件繪制統計圖，95%可信區間，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α 下調EOMA細胞中miR-338-3p的表達水平，激活MAPK信號通路活性，引起炎癥反應

與對照組比較，TNF-ɑ處理EOMA細胞24小時miR-338-3p的表達水平明顯降低(圖1 A)，同時黏附因子VCAM-1及ICAM-1 mRNA 表達水平升高(圖1 B、C)，Western blot 分析p-ERK及p-p38相對表達水平較對照組升高明顯(圖1 D)。結果表明，TNF-ɑ降低EOMA細胞中miR-338-3p表達水平，升高ERK/p38磷酸化水平，并增加黏附因子表達水平，引起炎癥反應，miR-338-3p可能參與其中。

2.2 低表達miR-338-3p 增強MAPK信號通路活性，上調黏附因子表達，誘導EOMA細胞炎癥反應

用miR-338-3p 低表達腺病毒及其陰性對照病毒分別轉染內皮細胞EOMA 48小時，結果顯示，與對照組比較miR-338-3p 表達水平明顯下降約40%(圖2 A)，黏附因子VCAM-1及ICAM-1的表達水平明顯升高(圖2 B、C)；同時Western blot分析p-ERK及p-p38 相對表達量明顯升高(圖 2 D)。結果表明，低表達miR-338-3p能夠加強MAPK信號通路活性，增加內皮細胞黏附因子VCAM-1及ICAM-1 mRNA的表達，從而誘導內皮細胞炎癥反應。

A.miR-338-3p表達水平；B.黏附因子VCAM-1表達水平；C.黏附因子ICAM-1表達水平；D.ERK/p38 MAPK 信號通路蛋白表達水平(n=3,*P<0.05,**<0.01))

圖1 TNF-ɑ 誘導內皮損傷產生炎癥反應

A.miR-338-3p表達水平；B.黏附因子VCAM-1表達水平；C.黏附因子ICAM-1表達水平；D.ERK/p38 MAPK信號通路蛋白表達變化(n=3,*P<0.05,**<0.01,***<0.001)

圖2 低表達miR-338-3p(miR-338-3p inhibitor)促進EOMA細胞炎癥反應

3 討論

據報道，心血管疾病在亞洲、非洲、南美等發展中國家的發病率高于5%，然而北美、歐洲、澳大利亞等發達國家的發病率不足3%，預測到2020年，心血管疾病死亡率居全球第一[6]。與心血管疾病最直接相關便是動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化是首先發生于動脈血管壁內皮細胞的一種并發炎癥性疾病[7]，各種危險因素如糖尿病、高血壓、血脂異常、肥胖、吸煙等都能導致血管內皮損傷[6]。研究證實一些炎癥介質如IL-6、黏附因子ICAM-1、單核細胞趨化蛋白MCP-1及氧化應激參與炎癥反應發生[8]。因此，探究內皮損傷炎癥反應發生的機制，將有助于對動脈硬化及心血管疾病的認識。

炎性因子是導致動脈粥樣硬化的重要因素。巨噬細胞、自然殺傷細胞及平滑肌細胞分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和IL-6[9]。TNF-α能夠誘導內皮細胞損傷，降低NO，增加VCAM-1表達水平[10]，激活p38MAPK/NF-КB信號通路活性[11]，導致細胞黏附性增強、炎性細胞趨化，從而產生炎癥反應。

一些miRNA如miR-181b[12]、miR-146a及miR-146b通過抑制抑制內皮細胞炎癥反應進而調控動脈硬化[13]。本研究發現，TNF-α處理內皮細胞，miR-338-3p的表達水平明顯降低，ERK及p38磷酸化水平明顯升高，黏附因子VCAM-1及ICAM-1的表達增多。結果表明TNF-α能夠抑制EOMA細胞中miR-338-3p的表達水平，且TNF-α能夠誘導內皮細胞損傷產生炎癥反應，提示miR-338-3p可能參與TNF-α誘導的內皮細胞損傷的炎癥反應。此外，我們還發現EOMA細胞中低表達miR-338-3p能夠增強ERK及p38蛋白磷酸化水平，升高細胞黏附因子VCAM-1及ICAM-1表達水平，結果表明低表達miR-338-3p能夠誘導EOMA細胞炎癥反應。

綜上所述，TNF-α能抑制EOMA細胞中miR-338-3p表達，且低表達miR-338-3p能誘導內皮細胞炎癥反應。本文揭示了miR-338-3p可能參與調控血管內皮炎癥反應，為動脈粥樣硬化提供新的治療靶點和方向，但其具體調控機制尚需進一步深入探討。

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MiR-338-3p low expression promotes inflammatory response signaling pathway in EOMA cells

YUShu-qian,SUIXiao-Fang*,WANGFeng-ling,etal.

(DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002，China)

Objective To study the role of miR-338-3p in the inflammatory response of endothelial cell line EOMA.Methods EOMA cells were treated with TNF-α 20 ng/ml,using Real-time PCR to detect the expression levels of miR-338-3p,adhesion factor VCAM-1 and ICAM-1,and western blot analysis of ERK and p38 MAPK signaling pathway activity.In order to decrease the expression of miR-338-3p,EOMA cells were transfected with miR-338-3p inhibitor for 48 hours.The expression of miR-338-3p and adhesion factor,such as VCAM-1 and ICAM-1 were detected by Real-time PCR.The protein associated with MAPK signaling pathway in this study were analysis of western blot.Results The expression of miR-338-3p was reduced and adhesion factor VCAM-1 and ICAM-1 expression was enhanced by endothelial cells EOMA treated with TNF-α 20 ng/ml for 24 hours.Western blot analysis of ERK/p38 MAPK signaling pathway activity was enhanced in endothelial cells induced by TNF-α.Down regulation of miR-338-3p expression was accompanied by enhancing expression of VCAM-1 and ICAM-1,and activating MAPK signaling pathway activity in endothelial cells EOMA infected with miR-338-3p inhibitor.Conclusion The expression of miR-338-3p was down regulated in EOMA cells induced treated with TNF-α;miR-338-3p inhibitor induced the inflammatory response of endothelial cells by activating the MAPK signaling pathway and enhancing the expression of adhesion molecules.

miR-338-3p；endothelial cells；inflammatory response；adhesion factor

黑龍江省自然基金面上項目(項目編號：H2015076)； 佳木斯大學研究生科技創新重點項目(項目編號：YZ2016_020)

1007-4287(2016)12-2002-04

R392

A

于淑倩(1987-)，在讀碩士研究生；隋小芳(1976-)，女，副主任醫師，碩士研究生導師，主要從事老年心血管疾病的臨床與基礎研究。

2016-04-21)

*通訊作者