綠茶提取物對乳腺癌細胞株MCF-7的作用機制探討

馮 強,李 毅,王文洋,夏鵬程,楊憲勇,張元湖

(1.泰安市中心醫(yī)院 檢驗科，山東 泰安271000;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院)

*通訊作者

綠茶提取物對乳腺癌細胞株MCF-7的作用機制探討

馮 強1.2,李 毅1,王文洋1,夏鵬程1,楊憲勇1,張元湖2*

(1.泰安市中心醫(yī)院 檢驗科，山東 泰安271000;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院)

目的 研究綠茶提取物的抗腫瘤活性。方法 不同濃度的綠茶提取物作用于MCF-7細胞，通過觀察細胞形態(tài)，檢測細胞周期和凋亡。結(jié)果 綠茶提取物可以阻滯人乳腺癌細胞株MCF-7生長周期于G1 期；熒光染色顯示細胞凋亡率增高，電鏡觀察，出現(xiàn)細胞染色質(zhì)濃縮、核周邊集，線粒體形態(tài)正常等細胞凋亡的典型特征；綠茶提取物作用后可以導(dǎo)致MCF-7細胞中Caspase3蛋白活性增強，促進腫瘤細胞的凋亡。結(jié)論 綠茶提取物對乳腺癌細胞均有一定的抑制作用，進一步篩選其有效成分可以用于腫瘤的預(yù)防與治療。

綠茶提取物；MCF-7；細胞凋亡；乳腺癌；抗腫瘤

(ChinJLabDiagn,2016,20:1999)

乳腺癌是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。在我國部分大城市，乳腺癌已居女性惡性腫瘤的首位[1]。有文獻表明，亞洲婦女罹患乳腺癌的風(fēng)險低于歐洲和美國婦女[2]，近年來多種研究證實，茶葉不僅能夠降脂、減肥、降壓、抗輻射之外，還含有抗病毒、抗腫瘤等天然有效成分，可抑制腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展[3]。但是綠茶提取物是否能真正有抑制腫瘤作用，尤其是對乳腺癌的抑制作用及其原理尚未明確。本研究希望通過探討綠茶提取物對乳腺癌細胞株MCF-7的誘導(dǎo)凋亡的作用機制，以期為尋找新的抗腫瘤天然藥物提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞株MCF-7由本實驗室保存。Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒、細胞周期試劑盒、TUNEL試劑盒購于Becton Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 倒置顯微鏡鏡及透射電鏡觀察細胞形態(tài)變化 用綠茶提取物濃度為20、40、60 μg/ml處理細胞，RPMI1640 作為空白對照，細胞處理48 h 后，固定后醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

1.2.2 MCF-7細胞周期和凋亡的檢測 配制濃度為1×106個/ml 的人乳腺癌細胞株MCF-7細胞懸液，分別加入20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、100 μg/ml 綠茶提取物溶液，于24 h、48 h、72 h各時間點取每組細胞進行MTT法檢測細胞凋亡率。同時，流式細胞儀上樣檢測，利用分析軟件CellQuest 計算細胞凋亡率；TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡情況。

1.2.3 Caspase-3蛋白檢測 采用鏈酶親合素生物素復(fù)合物 ( SABC )法加微波修復(fù)，按照說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件完成。各處理組均數(shù)與對照組比較用LSD-t檢驗.結(jié)果以mean±SD表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 綠茶提取物對MCF-7細胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下，對照組細胞生長狀況良好，透明度大,折光性強,細胞形態(tài)呈多邊形且連成片；隨著加入的綠茶提取物濃度的增加，細胞形逐漸出現(xiàn)皺縮，變圓，折光性變?nèi)酰毎麛?shù)目逐漸減少。

電鏡下，對照組MCF-7細胞的細胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)核糖體豐富，線粒體外膜和內(nèi)嵴完整。隨著綠茶提取物濃度的增加，細胞胞質(zhì)內(nèi)的線粒體損傷越來越嚴重，部分呈現(xiàn)空泡樣和髓鞘樣變。濃度達到60 μg/ml時，細胞核染色質(zhì)濃縮，凝集呈半月形或團塊狀，聚集在核膜內(nèi)緣，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多大小不等的空泡和自噬體，細胞外可查見大量細胞碎片。(圖1)

圖1 綠茶提取物對MCF-7細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響

2.2 綠茶提取物對MCF-7細胞凋亡的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，綠茶提取物對 MCF-7人乳腺癌細胞的抑制效果隨濃度升高而增加。100 μg/ml濃度處理 MCF-7人乳腺癌細胞時，抑制率高達53.47%。在24 h、48 h、72 h時，同一濃度的綠茶提取物抑制率逐漸升高，表明同一濃度的綠茶提取物的抑制率具有時間依賴性。(圖2-A)

應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測綠茶提取物對MCF-7的凋亡率。對照組在24h凋亡率為57.8±0.52，實驗組凋亡率為77.73±0.96，兩組間凋亡率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。不同濃度綠茶提取物作用于乳腺癌細胞48 h后，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(圖2-B)

TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡情況，通過熒光顯微鏡進行檢測，通過觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過綠茶提取物作用后的熒光明顯增強。流式細胞儀檢測綠茶提取物作用于人乳腺癌細胞株MCF-7 48 h 后， 40、60 μg/ml組 G1期及S期二倍體 DNA 含量變化顯著(P<0.05)，且各濃度組間比較差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細胞周期出現(xiàn) G1 期阻滯現(xiàn)象，S期細胞相應(yīng)減少，亞G1峰呈遞增態(tài)勢。提示綠茶提取物可使細胞周期阻滯于G1 期。(圖2-C)

2.3 綠茶提取物對對MCF-7細胞中Caspase-3活性的影響

通過圖3可以看出，綠茶提取物作用MCF-7細胞后，隨著綠茶提取物濃度的提高，Caspase-3活力逐漸升高，具有劑量依賴性；并且同一濃度的綠茶提取物組的Caspase-3活力隨時間的延長而升高，具有時間依賴性。(圖3)

3 討論

茶葉是亞洲人最喜歡，也是最普遍飲用飲料。目前，大量研究表明，綠茶提取物具有抗氧化、防癌、抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、增強機體抵抗力、降血糖和血脂、預(yù)防心血管疾病、抗衰老抑菌、除臭等多種功能[4]。

對腫瘤細胞周期的阻滯作用和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是綠茶提取物抑制腫瘤細胞生長的重要機理。細胞調(diào)控機制的紊亂，細胞失控性增長,其結(jié)果導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)可以通過影響腫瘤細胞生長周期正常進程而抑制腫瘤細胞的生長,可使腫瘤細胞停留在某一期"當癌細胞生長阻滯在G0期,達到某一程度和時間仍不能被解除使細胞無法進入S期和M/G2時，將激活細胞內(nèi)的某機制啟動程序,導(dǎo)致細胞無法正常分化而死亡[5，6]。EGCG抑制癌細胞生長,從而達到防癌抗癌的目的。細胞凋亡是在特定時空中發(fā)生的受機體嚴格調(diào)控的程序化細胞死亡過程。細胞凋亡被認為是一種正常的生物學(xué)老化現(xiàn)象。目前大多數(shù)化療藥物都是通過誘導(dǎo)細胞凋亡達到清除腫瘤細胞的作用。綠茶提取物抗腫瘤作用誘導(dǎo)人肝癌細胞、表皮癌細胞、鼻咽癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、前列腺癌細胞等腫瘤細胞凋亡已經(jīng)有很多人在研究[7]。我們的研究也證實綠茶提取物可以把瘤細胞周期的阻滯在G0/G1期，細胞增殖出現(xiàn)嚴重阻滯。Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能[8,9]。Caspase-3正常以酶原(32 KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17 KD)和兩個小亞基(12 KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

圖2 綠茶提取物對細胞凋亡的影響

圖3 綠茶提取物對MCF-7細胞中Caspase-3活性的影響

目前，食品中的各種生物活性物質(zhì)在癌癥形成的各個階段均有特定的保護作用。飲食與癌癥發(fā)生的眾多途徑有關(guān)，包括細胞凋亡、細胞周期的控制與分化、血管生成、DNA 修復(fù)以及致癌物質(zhì)的代謝[10]。對于綠茶提取物，在抗癌、防癌方面具有諸多功效，綠茶作為天然植物，其機理的最終探明，將為茶葉及其組分藥用價值的開發(fā)和臨床應(yīng)用，并最終造福人類。

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Research of The mechanism on Green Tea Extracts to Breast Cancer Cell Line MCF-7

FENGQiang,LIYi,WANGWen-xiang，etal.

(TheCentralHospitalofTaian,Taian271000,China)

Objective Green tea extracts have many effects on anti-cancer,but the corresponding mechanism is still exploring.Methods In this experiment,different concentrations of green tea extracts were applied onto MCF-7 cells.Results Typical characteristics of cell apoptosis,such as chromatin condensation,perinuclear clustering and mitochondria morphism,were observed in SEM pictures.The flow cytometry detected that green tea extracts can facilitate MCF-7 apoptosis and could retard MCF-7 growth at G1 stage.Fluorescence staining reflects that green tea extracts increases apoptosis rate.Conclusion Therefore,green tea extracts can be used as similar demethylated,low-toxicity and even nontoxic natural plant drugs for antineoplastic.

green tea extracts;MCF-7;apoptosis;breast cancer;anticarcinoma

1007-4287(2016)12-1999-04

R737.9

A

2016-03-27)