癌基因YAP1促進三陰性乳腺癌細胞生長遷移和腫瘤形成

胡麗梅

(白城中心醫院，吉林 白城137000)

癌基因YAP1促進三陰性乳腺癌細胞生長遷移和腫瘤形成

胡麗梅

(白城中心醫院，吉林 白城137000)

目的 研究YAP1在三陰性乳腺癌中的表達及其對乳腺癌細胞的影響。方法 采用免疫組織化學的方法在30例三陰性乳腺癌樣本中進行YAP1染色；通過RNA干擾技術研究YAP1對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖、遷移及皮下成瘤的影響。結果 與對照的正常乳腺組織相比，三陰性乳腺癌樣本中YAP1的表達量顯著升高；在MDA-MB-231細胞中敲低YAP1能夠顯著抑制其細胞增殖、遷移及腫瘤形成能力。結論 YAP1是潛在的三陰性乳腺癌診斷標志物和治療靶點。YAP1可以通過影響乳腺癌細胞的增殖和遷移來促進三陰性乳腺癌的發生發展。

YAP1；三陰性乳腺癌；細胞增殖；細胞遷移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1995)

乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤，約占女性新發惡性腫瘤的30%[1]。大部分的乳腺癌可以通過手術和放化療進行治療，然而一些惡性程度比較高的乳腺癌，如三陰性乳腺癌，仍然威脅著患者的生命。三陰性乳腺癌是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(Her-2)均為免疫組織化學檢測陰性的一種乳腺癌病理類型，占所有乳腺癌的15%[2]。相對于其它乳腺癌分型，三陰性乳腺癌預后更差且發病年齡更年輕[2]。遺憾的是，目前并沒有針對三陰性乳腺癌的標準治療指南。因此，加快三陰性乳腺癌的早期診斷和治療靶點的尋找成為乳腺癌研究的重要問題。

Hippo 信號通路是從果蠅到哺乳動物中高度保守的一條信號通路，這條信號通路可以同時調控細胞增殖和凋亡來調節組織器官大小。近年，Hippo信號通路在人類腫瘤中的研究備受關注[3,4]。Hippo 信號通路由一條激酶鏈和轉錄共激活子組成。簡單來說，上游信號激活MST1/2(serine/threonine kinase 4/3)和它的調節亞基SAV1 (Salvador family WW domain containing protein 1)，它們相互結合后促進MST1/2的活化并進一步磷酸化LATS1/2 (large tumor suppressor kinase 1/2)[5];當LATS1/2被激活后，YAP1/TAZ (yes associated protein 1/WW domain containing transcription regulator 1)立刻被其磷酸化而并定位在細胞漿中，從而限制了YAP1/TAZ進入細胞核中執行轉錄激活的功能。與此同時，細胞核中的轉錄因子 TEAD(TEA domain transcription factor family)失去了YAP/TAZ 的結合和共激活作用，直接導致下游轉錄基因表達下調，從而降低細胞增殖速度和遷移能力[6-10]。越來越多的研究表明， Hippo信號通路的成員在多種腫瘤中發生突變或擴增。例如，NF2在腦瘤中多發突變[11]；LATS2 表達量降低直接導致白血病對化療藥物敏感性降低[12]；TAZ在20%的侵潤性乳腺癌腫組織樣本高表達，其表達量與乳腺癌惡性程度成正相關[13,14]；而YAP1被發現在前列腺癌和肝癌的染色體上發生擴增[15]。這些數據表明Hippo信號通路的活化程度與腫瘤的發生發展密切相關。然而，關于Hippo信號通路與三陰性乳腺癌的研究非常有限。本研究旨在揭示YAP1與三陰性乳腺癌之間的關聯。

本研究檢測了30例三陰性乳腺癌樣本中YAP1的表達，染色結果表明YAP1在三陰性乳腺癌中過量表達，提示YAP1可能成為三陰性乳腺癌早期診斷的分子標志物。另外，YAP1的過量表達也預示著其在三陰性乳腺癌發生發展中扮演重要角色。細胞水平的研究表明YAP1可以促進三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和皮下成瘤能力。因此，靶向YAP1是一個潛在的三陰性乳腺癌的治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎腎細胞HEK293T和乳腺癌MDA-MB-231細胞由本實驗是保存；DMEM培養基和胎牛血清購于Invitrogen公司；脂質體轉染試劑盒Lipofectamine2000 購自Invitrogen公司；transwell小室購自于BD公司；YAP1 抗體購買于Cell Signaling Technology公司。pMKO-shYAP1(TRCN0000107266和TRCN0000107267)質粒購買于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學 5 μm厚的人乳腺癌樣本切片經65℃二甲苯脫蠟以及梯度酒精水化后，在檸檬酸緩沖液中進行抗原修復。具體修復條件為：95℃,30 min；121℃高壓，10 s；溫度降至85℃后室溫放置20 min。自來水沖洗3次后，用3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶。30 min后，TBST(Tris-buffered saline,0.1% Tween 20)洗滌3次，5 min。然后用10%馬血清封閉1 h。YAP1抗體按照1∶100稀釋于封閉液中并均勻覆蓋在組織切片表面，切片置于濕盒中4℃過夜。次日，切片用TBST洗滌3次，每次5 min，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。經TBST洗滌后進行DAB顯色。最后進行蘇木素復染、封片和拍照。三位研究者雙盲情況下對YAP1的表達水平給予評分(0-3分)。

1.2.2 YAP1敲低細胞株的建立 將狀態良好的HEK293T傳代。次日，按VSVG:GAG:pMKO-shYAP1(或pMKO空載體)=2∶2∶3的比例進行轉染(具體操作參照 Invitrogen 說明書)，6 h后換液。轉染24 h后開始收集培養基中的病毒，每隔8 h收集1次。通過3 000 rpm/min離心將收集好的病毒中殘留的HEK293T細胞去除后，用上清中的反轉錄病毒感染密度約40%的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞。感染48 h后開始加入嘌呤霉素篩選5 d至無細胞死亡。進行細胞凍存以及細胞增殖、遷移和體外成瘤實驗。

1.2.3 免疫印跡 在1×107狀態良好的細胞中加入1 ml 細胞裂解液(50 mM Tris,150 mM NaCl,0.5%NP40,新鮮加入蛋白酶抑制劑)于冰上裂解30 min。將裂解后的蛋白加入上樣緩沖液后在99℃煮10 min。10%丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。5%牛奶室溫封閉1 h后，加入YAP1抗體4℃過夜。次日，TBST洗滌3次后，加入二抗室溫孵育1 h。最后顯色并于暗室顯影。

1.2.4 細胞增殖實驗 取處于對數生長期的穩定表達pMKO-shYAP1細胞或者對照細胞進行胰酶消化及細胞計數；6孔板中每孔種植3×105個細胞，每個時間點設立三個重復。在生長曲線計數過程中，隔天更換新鮮的細胞培養液。從種植后第二天開始，每天用紅血球計數板進行計數。

1.2.5 細胞遷移實驗 穩定表達pMKO-shYAP1細胞或者對照細胞經過血清饑餓16 h后，胰酶消化及細胞計數，將細胞用無血清DMEM培養基懸浮；在24孔板下室中加入600 μl含5%胎牛血清的培養基，然后將小室放在24孔板中；取1×105個細胞加入Transwell小室，培養24 h；吸掉小室上層培養基，用PBS洗滌兩次，然后用4%多聚甲醛室溫固定20 min；用棉簽擦去上層小室內的細胞；將整個Transwell小室浸入到0.1%結晶紫中染色10 min，顯微鏡下拍照(拍攝小室的正中以及上下左右的5個視野)，計算穿過Transwell膜的細胞數。

1.2.6 皮下成瘤實驗 取處于對數生長期的穩定表達pMKO-shYAP1細胞或者對照細胞進行胰酶消化及細胞計數；將細胞以1×107的密度懸浮于PBS中，然后以皮下注射的方式注入到5-6周大的雌性BALB/c裸鼠中。每只裸鼠注射1×106個細胞，每個實驗組設立14只裸鼠。定期觀察裸鼠成瘤及健康狀況，四周后處死裸鼠，取出皮下腫瘤進行質量稱重及拍照。

2 結果

2.1 YAP1在三陰性乳腺癌樣本中高表達 免疫組織化學染色結果表明，YAP1 在正常乳腺導管上皮細胞中呈中等表達，而在三陰性乳腺癌樣本中則大量表達(圖 1)。對YAP1染色強度進行多名研究者雙盲打分后，統計學分析顯示YAP1在三陰性乳腺癌中表達量顯著高于正常乳腺組織(圖 1)。提示YAP1可能參與三陰性乳腺癌的發生和發展。另外，YAP1也是潛在的三陰性乳腺癌診斷標志物。

圖1 YAP1 在三陰性乳腺癌中的表達

免疫組織化學方法檢測YAP1在正常乳腺導管上皮細胞(左)和三陰性乳腺癌腫瘤細胞(中)中的表達，進一步統計學分析比較YAP1在正常和腫瘤組織中的表達差異(右)。免疫組化圖片為20倍放大。

2.2 特異性敲低三陰性乳腺癌細胞中YAP1的表達 為了研究YAP1在三陰性乳腺癌細胞中的作用，研究者運用RNA干擾技術特異性靶向三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231內的YAP1。如圖2所示，MDA-MB-231細胞中的YAP1表達量降低了90%。為了防止RNA干擾技術的脫靶效應，2條不同的shRNA被選擇進行敲低實驗。穩定敲低YAP1表達的細胞株的建立為后續研究YAP1對三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和皮下成瘤能力的影響奠定了基礎。

圖2 特異性敲低YAP1的表達

免疫印跡檢測shRNA干擾技術建立的穩定敲低YAP1的細胞株中YAP1表達量的變化，β-actin在這里視為內參(左)。免疫印跡的灰度值定量分析比較對照和shYAP1敲低細胞中YAP1的表達水平(右)。***表示P<0.001。

2.3 敲低YAP1抑制三陰性乳腺癌細胞增殖和遷移 Hippo信號通路在腫瘤中的作用主要表現在精密調控細胞增殖、遷移、浸入和上皮-間充質轉化等生物學過程。正如之前的研究報道，YAP1能夠顯著促進腫瘤細胞的增殖和遷移[15]，因此研究者利用RNA干擾技術來檢測YAP1對于三陰性乳腺癌細胞的增殖和遷移能力的影響。如圖 3(左)所示，在三陰性乳腺癌細胞中給敲低YAP1后，細胞的增殖活力明顯減慢。同時，transwell實驗表明，敲低YAP1顯著降低了MDA-MB-231細胞的遷移能力(圖 3右)。

2.4 敲低YAP1抑制三陰性乳腺癌細胞皮下成瘤能力 裸鼠皮下成瘤模型是檢驗腫瘤細胞成瘤能力的常規實驗。為了測定YAP1敲低是否能夠影響三陰性乳腺癌的腫瘤形成能力，我們進行了裸鼠皮下成瘤實驗。如圖 4所示，YAP1敲低的MDA-MB-231細胞仍然能夠在裸鼠體能形成腫瘤，但是腫瘤的體積和質量較對照組顯著減小。這一結果提示，如果能夠有效干預三陰性乳腺癌中YAP1的表達，則可以顯著減小腫瘤的大小。因此YAP1是一個潛在的三陰性乳腺癌的治療靶標。

3 討論

相對于其它病理類型的乳腺癌，三陰性乳腺癌患者具有較差的預后。這一現象的主要原因有兩個方面：不能有效的早期診斷和沒有行之有效的治療方案。究其根本，在于三陰性乳腺癌缺少早期診斷的標志物和靶向治療藥物的靶點。本研究表明，YAP1在三陰性乳腺癌中高表達，成為潛在的診斷標志物。同時。在三陰性乳腺癌細胞中敲低YAP1能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移和皮下成瘤能力。這一發現首次將YAP1和三陰性乳腺癌聯系起來，而且在細胞水平上提供了YAP1促進三陰性乳腺癌發生發展的證據。進一步的研究可以嘗試用Hippo信號通路的靶向藥物，如維替泊芬，來干預三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和成瘤能力，為下一步的臨床研究奠定基礎。

圖3 YAP1影響三陰性乳腺癌細胞的增殖和遷移

圖4 YAP1影響三陰性乳腺癌細胞的成瘤能力

在MDA-MB-231細胞中敲低YAP1后，將細胞注射入裸鼠皮下，4周后取出瘤體拍照(左)。同時腫瘤的重量被記錄后進行統計分析比較對照組和YAP1敲低組之間腫瘤重量的差別。***表示P<0.001。

[1]Slamon DJ,Clark GM,Wong SG,et al.Human brast cancer:correlation of relapse and survivsl with amplification of the HER-2/neu oncogene[J].J Science，1987,235(4785):177.

[2]Foulkes WD,Smith IE,Reis-Filho JS.Triple-negative breast cancer[J]. N Engl J Med,2010,363(20):1938.

[3]Pan D.The hippo signaling pathway in development and cancer[J].J Dev Cell,2010,19: 491.

[4]Zhao B,Li L,Lei Q,et al.The Hippo-YAP pathway in organ size control and tumorigenesis: an updated version[J].J Genes Dev,2010a,24: 862.

[5]Chan EH,Nousiainen M,Chalamalasetty RB,et al.The Ste20-like kinase Mst2 activates the human large tumor suppressor kinase LATS1[J].J Oncogene,2005,24: 2076.

[6]Zhao B,Wei X,Li W,et al.Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control[J].J Genes Dev,2007,21: 2747.

[7]Zhao B,Ye X,Yu J,et al.TEAD mediates YAP-dependent gene induction and growth control[J].J Genes Dev,2008,22:1962.

[8]Lei QY,Zhang H,Zhao B,et al.TAZ promotes cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition and is inhibited by the hippo pathway[J].J.Mol Cell Biol,2008,28:2426.

[9]Zhang H,Liu CY,Zha ZY,et al.TEAD Transcription Factors Mediate the Function of TAZ in Cell Growth and Epithelial-Mesenchymal Transition[J].J Biol Chem,2008,284: 13355.

[10]Zhao B,Li L,Tumaneng K,et al.A coordinated phosphorylation by Lats and CK1 regulates YAP stability through SCF(beta-TRCP)[J].J Genes Dev,2010b,24: 72.

[11]McClatchey AI,Giovannini M.Membrane organization and tumorigenesis-the NF2 tumor suppressor,Merlin[J].J Genes Dev,2005,19: 2265.

[12]Masahiro Kawahara,Toshiyuki Hori,Kazuhisa Chonabayashi,et al.Kpm/LATS2 is linked to chemosensitivity of leukemic cells through the stabilization of p73[J].J Blood,2008,112: 3856.

[13]Chan SW,Lim CJ,Guo K,et al.A role for TAZ in migration,invasion,and tumorigenesis of breast cancer cells[J].J Cancer Res,2008,68: 2592.

[14]Cordenonsi M,Zanconato F,Azzolin L,et al.The Hippo transducer TAZ confers cancer stem cell related traits on breast cancer cells[J].J Cell,2011,147: 759.[15]Overholtzer M,Zhang J,Smolen GA,et al.Transforming properties of YAP,a candidate oncogene on the chromosome 11q22 amplicon[J].J Proc Natl Acad Sci USA,2006,103: 12405.

Oncogenic protein YAP1 promotes triple-negative breast cancer cells proliferation,migration and tumorigenesis

HULi-mei.

(BaichengCentralHospital,Baicheng137000,China)

Objective To study the expression level of YAP1 in triple-negative breast cancer samples,and demonstrate the functional role of YAP1 in breast cancer cell.Methods IHC was performed for YAP1 staining in 30 pairs of triple-negative breast cancer specimens,and the staining intensity of YAP1 was scored;the effect of YAP1 on the proliferation,migration and tumorigenesis of triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231 was determined by shRNA knockdown system.Results compared with the normal breast tissue,triple-negative breast cancer samples have significantly higher level of YAP1 expression.Functionally,YAP1 could promote the proliferation,migration and tumorigenesis of triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231.Conclusion Our results indicate that YAP1 may serve as a biomarker for triple-negative breast cancer,and YAP1 could be a potential therapeutic target of triple-negative breast cancer via manipulating breast cancer cell proliferation,migration and tumor development.

YAP1;triple-negative breast cancer;cell proliferation;cell migration

1007-4287(2016)12-1995-04

Q291

A

2016-03-29)