人參皂苷Rg5對人食管癌細(xì)胞作用的研究

梅志宏,丁雅明,李 凡,付學(xué)奇，劉林林*，朱洪權(quán)*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)生命科學(xué)院)

人參皂苷Rg5對人食管癌細(xì)胞作用的研究

梅志宏1,丁雅明1,李 凡2,付學(xué)奇3，劉林林1*，朱洪權(quán)1*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)生命科學(xué)院)

目的 探索人參皂苷Rg5對人食管癌細(xì)胞Eca-109的作用及機(jī)制。方法 利用不同濃度人參皂苷Rg5在體外對人食管癌Eca109細(xì)胞作用不同時間，采用CCK-8法檢測細(xì)胞抑制率，Annexin V-FITC/PI雙染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，PI單染法檢測細(xì)胞周期。結(jié)果 在濃度分別為50、100 μmol/L的人參皂苷Rg5作用人食管癌細(xì)胞24 h后出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化，同時處于S期及G2/M期細(xì)胞較對照組明顯增多,分別為53.08%、25.84%和58.44%、31.48%，流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡率分別為11.45%、30.13%。 結(jié)論 人參皂苷Rg5能抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能為增加細(xì)胞早期凋亡，引起細(xì)胞周期滯留。

人參皂苷Rg5；食管癌細(xì)胞Eca109；細(xì)胞周期；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1982)

食管癌是常見的消化道腫瘤，2008年其全世界平均發(fā)病率居所有惡性腫瘤第9位；死亡率居第8位，而中國大陸食管癌發(fā)病率居全國各類惡性腫瘤第5位，死亡率高居第4位，顯著高于國際平均水平[1]。居高不下的發(fā)病率及死亡率嚴(yán)重威脅人類的健康。目前食管癌的治療手段主要是手術(shù)及放化療治療。因其解剖位置特殊，治療效果一般，預(yù)后較差,應(yīng)用新型藥物延緩其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是提高其治療療效的手段之一。

人參皂苷Rg5是從人參中提取的稀有人參皂苷，Rg5能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，Shin-jung Kim[2]等人從細(xì)黑參中提取的Rg5已驗證在人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-453)、Li-dan Liang[3]等報道Rg5能誘導(dǎo)多種宮頸癌細(xì)胞凋亡和DNA損傷,然而在該人參單體對食管癌細(xì)胞的作用未見報道。本研究通過體外細(xì)胞實驗證實人參皂苷Rg5對食管癌細(xì)胞具有抑制增殖作用，為臨床治療腫瘤開發(fā)新型中藥提供一定的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

該實驗采用的食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞由吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室保存。

1.1.2 人參皂苷Rg5

該實驗所用人參皂苷Rg5單體由吉林大學(xué)生命科學(xué)院從人參中分離及提供本次實驗。

1.1.3 主要試劑及實驗耗材

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自由NQBB公司；青-鏈霉素雙抗購自Gibco公司；凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC/PI為BD公司產(chǎn)品，周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，CCK-8為日本同仁產(chǎn)品。37℃恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀為Thermo公司設(shè)備，流式細(xì)胞儀為Beckman公司儀器。

1.2 方法

1.2.1 食管癌細(xì)胞抑制率檢測

采用cck-8法檢測細(xì)胞抑制率。取對數(shù)生長期的食管癌ECa109細(xì)胞4×104/ml，種于96孔板中，每孔100 μl，37℃孵育箱中培養(yǎng)24 h，并將Rg5稀釋于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μmol/L共5個濃度梯度，每組5個復(fù)孔，同時每組設(shè)置對照組(不加藥物)，空白組(只含培養(yǎng)基)，細(xì)胞種于96孔板培養(yǎng)24 h后吸去完全培養(yǎng)基，每孔加入100 μl上訴含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基，空白組及對照組也相應(yīng)加入不含血清培養(yǎng)基，37℃孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8,2h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度。全部細(xì)胞抑制率=(對照組-加藥組)/(對照組-空白組)×100%。

1.2.2 細(xì)胞生長狀態(tài)觀察

取對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞消化后種于6孔板中，每孔約3×105個。以每孔2 ml完全培養(yǎng)基下37℃培養(yǎng)箱中培育24 h，根據(jù)藥物的濃度曲線及時間曲線，更換含有50、100 μmol/L藥物濃度的不含血清培養(yǎng)基2 ml恒溫箱培養(yǎng)24 h，同時設(shè)立對照組(不含藥物)，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測

以Annexin V FITC/PI雙染色法檢測。取對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞消化后種于6孔板中，每孔約3×105個。以每孔2 ml完全培養(yǎng)基下37℃培養(yǎng)箱中培育24 h，根據(jù)藥物的濃度曲線及時間曲線，更換含有50、100 μmol/L藥物濃度的不含血清培養(yǎng)基2 ml恒溫箱培養(yǎng)24 h，同時設(shè)立對照組(不含藥物)。收集上述細(xì)胞及上清，1 000 rpm離心5 min后棄去上清，預(yù)冷的PBS洗2次，用1×緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×106/ml，取100 ul上訴細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，分別加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI，室溫避光15 min，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測

以PI(碘化丙啶)單染法檢測。取對數(shù)生長期的細(xì)胞種于6孔板中，每孔3×105個，2 ml完全培養(yǎng)基37℃孵育24 h，更換含有Rg5濃度為50、100 μmol/L的培養(yǎng)基2 ml培養(yǎng)24 h，同時設(shè)對照組。收集培養(yǎng)基，每孔1 ml胰酶消化收集后離心1 000 rpm、5 min，PBS洗滌1次離心，棄去上清后加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇5 ml固定，4℃過夜，800 rpm離心5 min后PBS洗去固定液，加入配好的含有染色緩沖液、Rnase、PI的染色液400 μl，37℃避光水浴30 min后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，Modfit軟件分析細(xì)胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1Rg5對細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的Rg5對Eca-109細(xì)胞作用后抑制其增殖，且隨著濃度和時間的增加，其抑制率相應(yīng)增加，經(jīng)過SPSS軟件分析，其24h的IC50為42.95μmol/L，48h的IC50為31.61μmol/L，我們選擇近50、100μmol/L濃度進(jìn)行以下實驗。如表1。

Rg5作用Eca109細(xì)胞的時間不同，其細(xì)胞抑制率不同，隨時間延長其抑制率增加，以50μmol/L濃度的Rg5觀察不同時間對Eca109的抑制率，見表2。

表1 不同濃度Rg5作用不同時間后細(xì)胞抑制率( ±s，%)

表2 50 μmol/L的Rg5與食管癌細(xì)胞作用不同時間抑制率

2.2 不同濃度與Eca-109細(xì)胞作用后生長情況 鏡下可見，隨濃度增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，其體積變小，部分出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落(圖1)。

2.3 Rg5對Eca109細(xì)胞周期的影響 食管癌細(xì)胞的周期受到Rg5的影響，隨著濃度的增加，其周期主要阻滯在G2/M、S期，而G0/G1比例相對減低。當(dāng)以50、100 mol/L濃度作用細(xì)胞24 h后，其S期、G2期與對照組相比，有明顯的差異性，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖1 不同濃度Rg5作用Eca-109細(xì)胞24 h后形態(tài)觀察

組別G0/G1SG2/M對照組51．64±3．2238．22±2．8512．14±2．4650μmol/L組21．08±2．18?53．08±3．34?25．84±3．08?100μoml/L組10．08±2．41?58．44±4．05?31．48±4．54?

注：*與對照組相比，P<0.05

2.4 Rg5對Eca109細(xì)胞增殖的影響 分別用50、100 μmol/L濃度Rg5作用Eca109細(xì)胞后可見細(xì)胞凋亡率增加，且隨濃度增加其早期凋亡率也增加。當(dāng)以50、100 μmol/L濃度作用細(xì)胞24 h后，其早期凋亡率與對照組相比，有明顯的差異性，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同濃度Rg5作用Eca109細(xì)胞24 h凋亡情況

注：C1:壞死細(xì)胞；C2：晚期凋亡細(xì)胞；C3：正常細(xì)胞；C4：早期凋亡細(xì)胞；與對照組比較，*P<0.05

3 討論

腫瘤的生長是一個復(fù)雜的過程，因其不能像正常細(xì)胞一樣進(jìn)行程序化凋亡而進(jìn)行無限增殖，因此，如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或產(chǎn)生細(xì)胞周期滯留致使細(xì)胞停止分裂或延遲分裂，是藥物治療腫瘤的最基本的幾種作用方式。

人參是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中重要的藥物，隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，其多種成分已被分離出來形成單體[4]，其中人參皂苷Rg3，已被制成抗腫瘤中藥應(yīng)用于臨床。Rg5作為一種新型人參單體，目前正被用于多種研究，Lee YY[5]等研究了Rg5在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的抗炎作用，Siddiqi[6]等報道了其在小鼠成骨細(xì)胞中的刺激作用，Chu[7]等人研究了人參皂甙Rg5通過減弱神經(jīng)炎癥反應(yīng)改善STZ誘導(dǎo)記憶受損大鼠的認(rèn)知功能障礙和β-淀粉樣蛋白沉積等。本實驗通過體外細(xì)胞實驗證明其對食管癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，這與之前報道的Rg5能誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞凋亡一致。本實驗發(fā)現(xiàn)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖通過影響細(xì)胞周期，主要是將細(xì)胞周期阻滯在S期和G2期，從而表現(xiàn)出其細(xì)胞毒作用，同時引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，并隨著濃度增加，其凋亡率也相應(yīng)增加。目前已有多項研究證實細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)有關(guān)，而細(xì)胞凋亡途徑主要有細(xì)胞膜途徑，線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三種。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過藥物作用后，經(jīng)過某一種途徑使細(xì)胞接受凋亡信號，會使凋亡調(diào)控分子進(jìn)行相互作用，繼而誘發(fā)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活化，致使細(xì)胞凋亡。 Rg5誘導(dǎo)的細(xì)胞周期改變和早期凋亡的發(fā)生是否與上訴因素有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。總體說來，本次實驗證實人參皂苷Rg5能在體外實驗中抑制食管癌細(xì)胞增殖，為臨床開發(fā)治療食管癌新藥提供一定的實驗基礎(chǔ)。

[1]赫 捷,邵 康.中國食管癌流行病學(xué)現(xiàn)狀、診療現(xiàn)狀及未來對策[J].中國癌癥雜志,2011,21(7):501.

[2]Shin-jung Kim，An Keun Kim,Anti-breast cancer activity of Fine Black ginseng (Panax ginseng Meyer) and ginsenoside Rg5[J].Journal of Ginseng Research,2015,39(2):125.

[3]Liang LD,He T,Du TW,et al,Ginsenoside-Rg5 induces apoptosis and DNA damage in human cervical cancer cells[J].Molecular Medicine Reports,2015,11(2):940.

[4]楊金玲,高麗麗,朱 平.人參皂苷生物合成研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報，2013,48(2):170.

[5]Lee YY，Park JS，Jung JS，et al.Anti-inflammatory effect of ginsenoside Rg5 in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J].Int J Mol Sci,2013,14(5):9820.

[6]Siddiqi MH，Siddiqi MZ，Ahn S，et al.Stimulative Effect of Ginsenosides Rg5:Rk1 on Murine Osteoblastic MC3T3-E1 Cells[J].Phytotherapy Research,2014，28(10):1447.

[7]Chu SH，Gu JF，F(xiàn)eng L,et al.Ginsenoside Rg5 improves cognitive dysfunction and beta-amyloid deposition in STZ-induced memory impaired rats via attenuating neuroinflammatory responses[J].Int Immunopharmacol,2014，19(2):317.

Effect of ginsenoside Rg5 on human esophageal cancer cells

MEIZhi-hong,DINGYa-ming,LIFan,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China)

Objective To explore the effect and mechanism of ginsenoside Rg5 on human esophageal cancer cell line Eca-109.Methods The inhibitory rate of human esophageal cancer cell line Eca109 in vitro was measured by CCK-8 method.The apoptosis rate of cells was detected by flow cytometry after Annexin V-FITC / PI double staining.Cell cycle.Results After treated with ginsenoside Rg5 at concentrations of 50 and 100 μmol/L for 24 h,the morphological changes were observed,and the cells in S phase and G2/M phase were significantly higher than those in the control group (53.08%,25.84%% and 58.44%,31.48% respectively(P<0.05).The early apoptotic rates were 11.45% and 30.13% respectively by flow cytometry(P<0.05).Conclusion Ginsenoside Rg5 can inhibit the proliferation of esophageal cancer Eca-109 cells,and its mechanism may be to increase the early apoptosis of cells,causing cell cycle arrest.

ginsenoside Rg5;esophageal cancer cell Eca 109;cell cycle;apoptosis

國家自然科學(xué)基金重大國際合作項目(項目編號：81320108025)

1007-4287(2016)12-1982-04

R735.1

A

2016-05-09)

*通訊作者