某奶牛場(chǎng)牛乳源金黃色葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性調(diào)查

韓淑芳，劉一飛，王國(guó)艷，王志宇，馬馨，梁佶宇，李希

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

某奶牛場(chǎng)牛乳源金黃色葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性調(diào)查

韓淑芳，劉一飛，王國(guó)艷，王志宇，馬馨，梁佶宇，李希

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

從山西某奶牛場(chǎng)隨機(jī)采集25份奶樣，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、H2O2酶試驗(yàn)鑒定，并對(duì)其進(jìn)行了9種藥物的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，從25份奶樣中分離出18株金黃色葡萄球菌；這18株金黃色葡萄球菌對(duì)多種藥物呈現(xiàn)出耐藥性，其中，對(duì)阿莫西林耐藥率最高，達(dá)77.8%，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磷霉素、頭孢曲松的耐藥率介于11.1%～44.4%，對(duì)左氧氟沙星的耐藥率最低，為5.6%。說(shuō)明金黃色葡萄球菌為該奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎的主要致病菌，該場(chǎng)奶牛對(duì)9種抗生素產(chǎn)生了普遍的耐藥性，建議該奶牛場(chǎng)以體外藥物敏感試驗(yàn)為參考，進(jìn)一步擴(kuò)大藥物的篩選范圍，選擇更多敏感藥物進(jìn)行治療。

牛乳；金黃色葡萄球菌；分離鑒定；耐藥性

奶牛乳房炎是當(dāng)前奶牛群中普遍流行的疾病，業(yè)已成為導(dǎo)致奶牛業(yè)嚴(yán)重?fù)p失的主要疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原菌種類較為復(fù)雜，常因地域、季節(jié)及飼養(yǎng)管理水平的差異而呈現(xiàn)出不同種類、不同比例的病原菌感染。而金黃色葡萄球菌目前仍是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，甚至占到奶牛乳房炎中病原體的50%以上[1]。奶牛乳房感染金黃色葡萄球菌常導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生急性、亞急性和慢性感染癥狀。據(jù)報(bào)道，在奶牛場(chǎng)中，臨床型乳房炎的發(fā)病率為2%～8%，隱性乳房炎的發(fā)病率更高，并且難以自愈[2-3]。該菌屬可侵害奶牛乳房上皮細(xì)胞引起嚴(yán)重的纖維性炎癥，并影響腺泡的分泌功能，使產(chǎn)奶量急劇下降；還可產(chǎn)生多種毒素污染乳汁，經(jīng)煮沸消毒仍不能將其滅活。飲用金黃色葡萄球菌污染的牛奶，會(huì)導(dǎo)致劇烈的嘔吐、腹瀉和發(fā)熱病癥。因此，該菌的傳播對(duì)奶牛健康和食品安全造成了嚴(yán)重威脅[3-9]。

目前，臨床治療金黃色葡萄球菌感染的主要措施仍是運(yùn)用各類抗生素，但由于抗生素的超劑量和頻繁使用，使其耐藥譜不斷擴(kuò)大，產(chǎn)生的多重耐藥情況越來(lái)越普遍，常使得臨床治療面臨無(wú)藥可用的困境，進(jìn)而導(dǎo)致其將耐藥性由奶源傳遞給人類，給公共衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)重隱患[5，10-14]。

本研究從山西省某奶牛場(chǎng)送檢的25份牛乳中，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和染色鏡檢初步分離出18株金黃色葡萄球菌，并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，旨在了解該奶牛場(chǎng)流行菌株的耐藥情況，并為臨床治療奶牛乳房炎的抗生素篩選提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

乳樣：山西省某奶牛場(chǎng)送檢的分別從25頭疑患乳房炎的奶牛采集到的25份牛乳各5～10 mL。

菌株：質(zhì)控菌株（金黃色葡萄球菌ATCC25923），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

培養(yǎng)基：普通瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)肉湯，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；血液瓊脂平板，購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

藥敏紙片：其包括環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素共9種，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 乳樣細(xì)菌的分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察無(wú)菌吸取0.5 mL各乳樣，分別加入5 mL的肉湯培養(yǎng)液中，于37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察肉湯濁度。再用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落顏色、形態(tài)。挑取疑似葡萄球菌的優(yōu)勢(shì)菌落再次劃線接種于血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察溶血情況并經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.2 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)用接種環(huán)挑取染色鏡檢后的疑似菌落涂抹于載玻片上，在其上滴加2～3滴3%的H2O2，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的藥物敏感試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素等9種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)18～24 h后量取抑菌圈直徑，其結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）制定標(biāo)準(zhǔn)判讀。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

普通肉湯中呈現(xiàn)出明顯的渾濁，有沉淀，且在管壁形成菌環(huán)。普通瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落呈圓形、濕潤(rùn)、不透明、邊緣整齊、表面隆起光滑，顏色呈檸檬色或黃色（圖1）。將瓊脂平板上的優(yōu)勢(shì)菌落接種血液瓊脂平板后，未見形成明顯的β溶血環(huán)（圖2）。初步分離出18株金黃色葡萄球菌。

2.2 染色鏡檢結(jié)果

分離菌落經(jīng)染色鏡檢，可見不規(guī)則排列成葡萄串樣的革蘭氏陽(yáng)性球菌（圖3）。

2.3 H2O2酶試驗(yàn)結(jié)果

受試的18株菌落均產(chǎn)生氣泡，說(shuō)明18株菌均為H2O2酶陽(yáng)性。

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

表118 株金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)18株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷，即抑菌圈直徑≥20 mm為高度敏感，16mm＜直徑＜20mm為中度敏感，直徑≤16 mm為耐藥。由表1可知，分離的18株金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素均呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。其中，分離菌株對(duì)阿莫西林的耐藥率最高，達(dá)77.8%，對(duì)左氧氟沙星的耐藥率最低，為5.6%，對(duì)其余7種抗生素的耐藥性介于11.1%～44.4%。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、染色鏡檢、過(guò)氧化氫酶等試驗(yàn)方法對(duì)25份奶樣中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了初步分離鑒定。結(jié)合菌落在平板上的金黃色菌落、染色鏡檢呈陽(yáng)性葡萄串樣、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性的結(jié)果，初步認(rèn)定試驗(yàn)分離出18株金黃色葡萄球菌，推測(cè)其是引起該場(chǎng)奶牛乳房炎的優(yōu)勢(shì)菌株。但分離菌株在血瓊脂平板培養(yǎng)后，并未形成明顯的β溶血環(huán)。由于大多數(shù)致病性金黃色葡萄球菌經(jīng)血瓊脂平板培養(yǎng)后均呈現(xiàn)β溶血環(huán)[15]，本試驗(yàn)的分離菌株是否為致病性菌株還有待后續(xù)開展分離菌株的致病性試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)。

本試驗(yàn)的藥敏結(jié)果顯示，分離出的18株金黃色葡萄球菌除對(duì)左氧氟沙星耐藥率最低（5.6%）外，對(duì)環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、慶大霉素都呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中，阿莫西林的耐藥率最高（77.8%）。這與王冰等[16]報(bào)道的呼和浩特地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對(duì)阿莫西林產(chǎn)生耐藥性最多的結(jié)果相近。對(duì)卡那霉素、慶大霉素和阿米卡星的耐藥性居其次（44.4%，38.9%，33.3%），高于王桂琴等[17]報(bào)道的卡那霉素耐藥率（26%）和阿米卡星耐藥率（6%），高于錫林高娃等[18]報(bào)道的慶大霉素耐藥率（0），其余抗生素如環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢曲松的耐藥率在16.7%～22.2%，與王桂琴等[17]報(bào)道的環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢曲松耐藥率（12%，12%，14%）相近，但顯著高于錫林高娃[18]報(bào)道的環(huán)丙沙星、氧氟沙星耐藥率（0，4.2%），與高延玲等[19]報(bào)道的頭孢曲松耐藥率（13.4%）相近，但低于氧氟沙星耐藥率（25.6%）。此外，本試驗(yàn)還選用了臨床上較少使用的磷霉素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)磷霉素也產(chǎn)生了一定的耐藥性，耐藥率為11.1%。本試驗(yàn)中耐藥率最低的是左氧氟沙星，18株金黃色葡萄球菌分離株中僅有1株耐藥，耐藥率為5.6%，與賴金倫等[20]試驗(yàn)結(jié)果較為一致。提示左氧氟沙星可作為治療該奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎的備選藥物。

由于本試驗(yàn)所分離菌株的數(shù)量相對(duì)較少，且與各相關(guān)報(bào)道中的受試菌株基數(shù)也不盡一致，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌對(duì)各抗生素的耐藥率與相關(guān)報(bào)道存在一定的差異。因此，本試驗(yàn)結(jié)果僅對(duì)受試奶牛場(chǎng)的病原流行病學(xué)、耐藥性調(diào)查和藥物選擇具有指導(dǎo)性，并不具有廣泛的通用性和代表性。山西省內(nèi)更大范圍的奶牛乳房炎流行狀況及其病原菌金黃色葡萄球菌的耐藥情況還需不斷擴(kuò)大病原菌的分離數(shù)量作進(jìn)一步的試驗(yàn)調(diào)查。

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Isolation，Identification and Drug Resistance Survey of Staphylococcus
aureus from Milk in a Dairy Farm

HANShufang，LIUYifei，WANGGuoyan，WANGZhiyu，MAXin，LIANGJiyu，LI Xi
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

25 milk samples were collected from a dairy farm in Shanxi province,meanwhile some procedures such as isolation and cultivation of bacteria,staining and observation,H2O2enzyme test,and analysis of drug resistance to9 drugs were conducted respectively. A total of 18 S.aureus strains were identified successfully from 25 suspected colonies.The result showed that 18 S.aureus strains presented multidrug resistance strains.Resistance rate of all S.aureus strains to amoxicillin was the highest,up to 77.8%.Resistance rates were 11.1%-44.4%,to kanamycin,gentamicin,amikacin,ciprofloxacin,ofloxacin,fosfomycin and cefoxitin.Resistance rate of levofloxacin was the lowest,only 5.6%.The result indicated that S.aureus strains were the pathogenic bacteria of bovine mastitis in the dairy farm,and produced drug resistance to 9 drugs.Treatment should be carried based on the drug sensitivity test to selecte more sensitive drugs.

milk;Staphylococcus aureus;isolation and and identification;drug resistance

S858.23

A

1002-2481（2016）11-1696-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.28

2016-06-16

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項(xiàng)目（YGG1427）

韓淑芳（1979-），女，山西左云人，助理研究員，主要從事畜禽養(yǎng)殖技術(shù)研究工作。劉一飛為通信作者。