運用空間協方差模型分析高血壓對大鼠大腦老化的影響

林嵐，張柏雯，付振榮，賓光宇，高宏建，吳水才

北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

運用空間協方差模型分析高血壓對大鼠大腦老化的影響

林嵐，張柏雯，付振榮，賓光宇，高宏建，吳水才

北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

隨著老齡人口的增多和生活水平的提高，我國的高血壓人數不斷增加，由高血壓引發的大腦老化已逐漸成為影響健康的重要因素之一。高血壓患者的大腦在中年期已經開始受到一定程度的損害，導致其認知能力逐漸衰退。本研究利用空間協方差模型，分別從大鼠青年組、老年組的磁共振顯微圖像（MRM）中提取大鼠腦老化的特征模式，并將該模式運用到高血壓大鼠組。結果顯示青年組與高血壓組的網絡分數存在顯著差別。水迷宮測試的結果也顯示網絡分數與迷宮學習指數成負相關。實驗結果證實短期存在的高血壓可以加速大腦老化。可以利用高分辨率的大鼠腦MRM圖像結合網絡分析方法，開展由高血壓引起的相關的腦部變化的治療和預防評估工作。

大鼠腦；磁共振顯微成像；高血壓；協方差模型

0 引言

高血壓是一種以動脈血壓持續升高為主要臨床特征的慢性病癥，是最常見的心血管疾病。它是腦卒中、心肌梗塞、心力衰竭及慢性腎病的主要危險因素之一[1]。在我國，高血壓存在著患病率高、死亡率高、殘疾率高的“三高”現象，卻又同時存在著知曉率低、治療率低、控制率低的“三低”特點。早在2002年全國居民營養和健康狀況調查顯示，我國成人高血壓患病率達到了18.8%，而且在中、老年人群中，有近一半已被確診為高血壓[2-3]。近年來，我國已成為受高血壓病癥及其后遺癥危害最為嚴重的國家。早期高血壓對大腦的認知功能的影響是隱秘的。其患者可能不會意識到自己的已經出現了認知衰退的問題，而把它誤認為是大腦的正常老化，但長期、持續的高血壓會加速其患者，尤其是中年患者的大腦老化進程。研究發現，高血壓患者出現認知障礙的風險比同年齡血壓正常的人高出40%[4]。持續的血壓較高會導致記憶力、執行功能和信息處理速度衰退等問題的提早發生[5-7]。中年期的血壓升高被發現會加速老年期的認知衰退，并且會提高阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）的患病風險[8]。大量數據表明，高血壓對與年齡有關的認知能力也有著顯著影響[9]。此外，長期的高血壓更是被證實與腦萎縮直接相關。在高血壓病人中，與記憶有關的區域（如海馬區）萎縮程度更為明顯[10-13]。高血壓患者的大腦比同齡受試者老了約4.1歲[14]，到目前為止，醫學界關于降壓藥物對大腦認知影響的研究，尚沒有統一的定論[15-16]。這可能是由于降壓藥物的治療主要是針對老年人，而這些老年人的大腦結構可能已經無法修復。所以研究中年期高血壓對認知的影響顯得尤為重要。總的說來，中年時期的高血壓可以作為一種風險指標來預測未來20年的認知衰退和AD的發病率。

高血壓常常伴隨著諸多同源性疾病的發生。例如，高血壓病人很容易同時患上糖尿病或高血脂。高血脂是造成動脈硬化形成和發展的主要因素。動脈硬化使得患者血管彈性差、外周阻力加大，從而加劇了血壓的升高。另據臨床調查統計，很多高血壓病人常伴有糖尿病，而糖尿病也較多的伴有高血壓。除了高血壓與糖尿病被猜測存在共同的遺傳基因之外，對于造成這種現象的主要原因，一方面可能是糖尿病病人的血管對于具有升壓作用的血管緊張素的敏感度較高；另一方面是由于糖尿病易引起腎臟損害，而腎臟功能的損害進而引起血壓的升高。迄今為止，大多數對高血壓對大腦認知能力改變的研究中，并沒有考慮到這些同源性疾病所帶來的影響。高血壓對大腦的傷害究竟主要是由于高血壓本身造成的，還是其它因素也起著關鍵的作用？中、短期的高血壓會對大腦造成傷害嗎？小動物磁共振顯微（MR microscopy，MRM）成像[17]使得我們可以無創、高空間分辨率地成像，非常適合于動物大腦形態及其功能的微小變化研究。在這項研究中，我們通過對大鼠模型的大腦模型進行MRM成像，來探究短期高血壓狀態是否會加速大腦的老化。

1.1 研究對象與數據獲取

采用15只雄性Fischer344大鼠（10只9月齡大鼠和5只24 月齡大鼠）， 其中10只9月齡的大鼠被隨機平均分配到青年組和高血壓組，而5只24月齡的大鼠被分配到老年組。首先在高血壓組的大鼠皮下埋置微量滲透泵,持續泵入血管緊張素Ⅱ（Angiotensin II）8周，4周后更換一次滲透泵。血管緊張素Ⅱ的劑量為1.2 mg/kg/d，8周后取出微量滲透泵。

青年組和高血壓組在12月齡時接受MRM采集，而老年組的大鼠在24月齡時接受MRM采集。圖像采集使用Bruker Biospec 7T/20 cm小動物MRM成像儀(Bruker BioSpin；Ettlingen，Germany)。72 mm內徑的線性鳥籠線圈被用于激發，一個四單元相控陣列表面線圈被用于接收。用異氟烷（1%）與氧和空氣以1：3的比例對大鼠進行麻醉。將大鼠放置在動物約束系統進行頭部固定。首先通過笛卡爾快速自旋回波掃描序列獲得128張連續T2加權像。掃描參數為：TR/TE =1500 ms/40 ms，回波鏈長度8，翻轉角=90°，層厚=0.15 mm，體素大小= 0.15 mm×0.15 mm ×0.15 mm，矩陣256×192，FOV為384 mm×288 mm。在MRM掃描前的一周，通過為期4 d的Morris水迷宮測試任務[18-19]，用強迫實驗大鼠游泳并學習尋找隱藏在水中平臺的方法來測試大鼠的運動能力，以及視覺和空間學習能力。

1.2 圖像預處理

首先將圖像由原始文件格式轉換為NIFTI格式，之后將像素體積調整到與人腦MRI相同體積(1 mm3)。由于受RF線圈等因素的影響，偽影是MRI圖像不可避免的問題。小動物MRM由于采用高場強進行數據采集，這一問題更為突出。偏差場在MRM圖像上呈現出無規律的、漸近的平滑灰度變化。在這里，我們通過對非參數非均勻強度歸一化方法進行優化參數設計[20-21]，校正了大鼠大腦MRM圖像中的灰度不均勻現象。腦組織提取是神經影像學分析的一項重要預處理過程，在此筆者采用一種結合腦模板和自適應閾值的混合方法[22]，實現非腦組織如顱骨或頭皮腦組織的分離。

1.3 Dartel處理

Dartel處理主要使用SPM8 (Statistical Parametric Mapping，London，UK)軟件包[23]，運行環境為MATLAB 7.6 (Mathworks，Natick，MA，USA)。利用SPM8軟件包所配備的VBM Dartel軟件包[24]完成分析。數據處理的基本步驟包括：首先根據通過高維非線性配準建立一個大鼠全腦平均模板[25]。基于MRIcro軟件(Smith 2002)手工獲取大鼠腦灰質、白質和腦脊液的劃分。以4 mm半高全寬高斯核對劃分結果進行空間平滑,以平滑結果為先驗概率圖像，通過統一分割框架[26]迭代分割，直到結果收斂。基于這個先驗概率圖像，再將所有受試大鼠的MRM圖像分割，得到每個被試大鼠的灰質、白質圖像和分割參數。運行Dartel軟件：首先利用受試大鼠的分割參數，得到嚴格校準的灰、白質圖像。然后將所有受試大鼠圖像的平均作為初始模板，進行6次迭代，每次迭代均將所有個體大鼠的圖像與前一次的大鼠模板進行配準，產生一系列流動場。將配準后的個體圖像再次平均得到新的模板，直到最后生成最優模板。將剛性對齊的灰、白質圖像與最優模板進行非線性配準，同時選擇進行調制，生成調制后的圖像。使用4 mm半高全寬高斯核對圖像進行空間平滑。最后得到可用于后續統計分析的平滑、調制后的標準化數據。

1.4 多變量分析

多變量分析被用來確定與大鼠腦老化相關的腦網絡特征參數。采用尺度子配置模型（Scaled SubprofileModel，SSM)[26-27]來建模，SSM是一種協方差分析方法，它通過捕獲組間和組內差異的主要來源，產生一系列主成分（Principle Components，PCs）的統計方法。主成分線性組合的最佳擬合可以將對大腦老化貢獻最大的腦網絡特征起到最好的保持作用。分析的步驟如下：① 首先將調制后的標準化數據進行預處理：數據的自然對數變換與均值的去除，消除不同指標間的量綱差異和數量級間的差異；② 主成分分析捕獲變化的主要來源，并產生了一系列的PCs；③ 運用Akaike信息判據（Akaike Information Criterion，AIC）法找出最能反映大腦老化的PCs，創建線性組合模式。最后，將提取的大鼠腦老化的特征模式運用在高血壓大鼠上，得到其對應的網絡分數。

2 結果

由圖1(a)可知，在高場強的大鼠MRM上，存在很強的偏差場。由圖1(b)可知，通過對N3算法進行參數優化，可以有效地消了MRM圖像中存在的偏差場，并且不同腦組織間對比度得也到了加強。

圖1 非均勻場校正和非腦組織去除

通過對青年組與老年組PCs的AIC分析確定前兩個主成分的線性組合與大腦老化直接相關（R2= 0.876，P＜0.001，圖2）。這兩個主成分可以較好反映大腦老化信息。通過回歸模型，可以得到其線性組合。前兩個PCs的回歸線性組合為大腦老化的特征模式。大鼠大腦的老化模式主要表現為雙側前額葉、邊緣皮層和基底神經節部分的腦萎縮以及雙側丘腦和中腦區域腦區的相對增長（圖3）。

MRM灰質模式反映了通過SSM取得的前兩個主成分的線性組合，在通過500次bootstrap重采樣后，Z＞4或Z＜-4的體素被疊加在MRM圖像上。

將大鼠腦老化特征模式應用在高血壓組大鼠上時，可以得到高血壓組與老化特征相對應的網絡分數（圖4）。將三組對象的網絡分數進行單因素方差分析(One-Way ANOVA），ANOVA結果顯示,四組對象的網絡分數的平均值存在顯著性差異（F(2,14)=36.6，P＜0.001）。最小顯著差法多重檢驗結果顯示，兩組間均存在顯著性差異(其中青年組與高血壓組兩兩比較結果為P=0.011)。

圖2 多變量的模式分類分析年齡分組與網絡分數間的關系

圖3 與年齡相關的大鼠腦灰質局部網絡特征模式

圖4 與腦老化模式對應的青年組、老年組和高血壓組的網絡分數

在Morris水迷宮測試中，計算修正的綜合路徑長度（Corrected Integrated Path Length，CIPL)[28]。CIPL可以避免結果中引入由于游泳速度和釋放位置的差異帶來的影響。結果顯示網絡分數和迷宮學習指數存在著負相關（R2= 0.322，P=0.027，圖5）。

圖5 迷宮學習指數和網絡分數間的關系

3 討論

在此研究中，可以通過多變量分析來確定前兩個PCs與大鼠老化相關的腦局部網絡特征模式。這個特征模式能夠將青年組和老年組的大鼠很好的區分（P＜0.001）。筆者還發現，盡管青年組與高血壓組的大鼠年齡一致，但在與大腦老化相關的網絡分數上卻存在著顯著的差異（P=0.011），這說明短期高血壓對大腦的老化進程可以起到非常大的作用。最后，對于這三組實驗對象，存在與大腦老化相關的網絡分數越高，Morris游泳任務中學習能力越差的現象（P=0.027）。大腦老化的網絡分數不僅可以反映大腦的萎縮程度，而且可以在一定程度上反映大腦認知能力的變化。這項研究，可以為識別AD的潛在風險，并為進一步進行相關疾病的干預或治療提供了重要的依據。總之，基于MRM的多變量網絡分析可以幫助深入闡釋動物大腦由生理性衰老到病理性衰老的潛在演變過程，并為進一步針對神經退行性疾病的動物模型治療的研發提供干預手段。

4 結論

本研究當前的實驗結果僅是基于15只大鼠進行實驗得到的，還屬于一個初步的結論。因此，未來還需要對更多大鼠進行測試和比較，來進一步驗證并推廣這一結果。研究顯示，短期的高血壓就可以對大腦造成損傷，加速大腦老化。但大腦衰老的速率并不是固定的，而且是可塑的。因此，未來可以進一步研究降壓藥物對大腦損傷是否存在修復作用。此外，應進一步探討的是隨著大腦老化，腦內功能性聯絡會出現中斷，這就會導致重要激素和自主神經系統反饋環的破壞。而這種整合功能的缺失可能會促進高血壓增齡性的生理變化，增加個體對增齡性腦疾病的易感性。因此，在未來的研究中，可以從生理變化整合中樞的角度探索大腦老化和高血壓之間的關系。

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Application of Spatial Covariance Model in the Analysis of the Impact of Hypertension on Rat Brain Aging

LIN Lan, ZHANG Bai-wen, FU Zhen-rong, BIN Guang-yu, GAO Hong-jian, WU Shui-cai
College of Life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China

With the increase of the aging population and the enhancement of people’s living standards in China, the impact of hypertension (HTN) on the brain aging has become an important health issue. When patients are still in their middle age, HTN has caused a certain degree of damage to the brain. These asymptomatic damage can cause progressively cognitive decline. In the present study, we used spatial covariance model to extract the age-related patterns from the young and old group of rats with magnetic resonance microscopy (MRM). Then we applied this pattern to the rats with HTN. The results showed that the young group and the HTN group had significant difference in network scores, and the network scores were negatively corrected with water maze learning index. Overall, these findings prove that short term HTN may accelerate the brain aging process. The preliminary result supports the using of high resolution rat brain MRM, with network analysis in the evaluation of new treatments for and prevention of the brain changes associated with HTN.

TP273

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.02.008

1674-1633(2016)02-0034-05

2015-09-15

北京市自然科學基金（7143171）資助。

林嵐，副教授。

通訊作者郵箱：lanlin@bjut.edu.cn

Abstract:: rat brain; magnetic resonance microscopy; hypertension; spatial covariance modeling