PS/APP雙轉基因小鼠大腦中β-淀粉樣蛋白的磁共振顯微成像和組織切片研究

林嵐，付振榮，張柏雯，周著黃，高宏建，吳水才

北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

PS/APP雙轉基因小鼠大腦中β-淀粉樣蛋白的磁共振顯微成像和組織切片研究

林嵐，付振榮，張柏雯，周著黃，高宏建，吳水才

北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

目的探討雙轉基因小鼠PS/APP大腦三維磁共振顯微成像（MRM）的T2圖與二維組織切片中Aβ斑塊之間的關系。方法本文提出了一個高效、全自動的圖像處理流程，即先通過未染色的二維組織切片重建三維腦模型，之后將其與三維MRM數據配準。配準是一個多步的過程，首先對鄰接的二維切片進行配準，然后再進行迭代的二維和三維配準。結果該流程可以較好配準組織切片與MRM，并能在T2圖和染色切片上發現一定的Aβ斑塊間的對應關系。結論通過神經影像技術來對轉基因小鼠大腦中的Aβ斑塊進行監測，了解阿爾茨海默癥（AD）中Aβ斑塊的產生、沉積和清除過程。

β-淀粉樣蛋白；磁共振顯微成像；阿爾茨海默病

0 引言

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）[1-2]是一種發病率隨年齡增長而成倍增加的， 進行性發展的致死性神經退行性疾病，是癡呆的主要病因之一。臨床表現為認知和記憶功能的不斷衰退、日常生活能力進行性減退，并可能伴有各種神經精神癥狀和行為障礙。隨著人類壽命的延長，AD正變得日益流行。在60歲以下只有1%的人群患有AD，而超過85歲的人中幾乎50%都患有AD。AD的發病機制尚未精確地闡明，如遺傳、免疫、環境及神經遞質等都可能參與致病。所以AD病因病理具有多樣性、異質性和復雜性等特點。AD的特征性病理改變為β淀粉樣蛋白（β-amyloid Protein，A β）在大腦皮層和海馬的沉積，從而形成老年斑、tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結（Neurofibrillary Tangles，NFTs），并且會導致腦皮層和海馬區神經元細胞的減少[3-4]。

典型老年斑的核心是由直徑為5～10 nm的微絲組成的Aβ聚集而成。Aβ經神經元產生分泌后，會在腦內形成高度聚集的、可溶狀態的寡聚體，然后進一步形成Aβ纖維而沉積在腦內。越來越多的研究結果顯示，Aβ在AD的發生、發展過程中起著主導性的作用。例如， “淀粉樣蛋白假說”[5]認為腦組織內Aβ的沉積是AD發生的最初起因，所有AD的其它病理改變，包括含有tau蛋白的NFTs形成、突觸缺失和神經細胞死亡，都可能由于大腦內Aβ的清除速率小于其產生速率而引起的。治療AD需要對不同階段的Aβ進行不同的處理。在臨床前期，目標為如何防止Aβ的產生；在輕度認知受損階段，目標為怎樣去除Aβ斑塊；而在癡呆階段，目標為設法解決Aβ的沉積。當前，科學研究的焦點主要集中于如何預防Aβ的形成以及怎樣能抑制Aβ沉積而形成不可溶的斑塊。

PS/APP雙轉基因的AD小鼠模型由于可以在小鼠大腦形成Aβ斑塊，已被廣泛運用于AD研究之中[6-7]。常用的實驗方法是對小鼠大腦進行組織切片，一般通過固定、冰凍、數碼照相等方法獲取到組織切片。但這種方法工作量比較大，而且無法比較同一小鼠大腦隨時間變化而產生的改變。當前，在動物模型的研究中，提供Aβ斑塊的定量和可視化的神經影像技術變得越來越重要。磁共振顯微成像（Magnetic Resonance Microscopy，MRM）已經被廣泛用于小鼠模型上來對Aβ斑塊進行檢查[8-10]。在這項工作中，了解MRM成像中得到Aβ斑塊與組織學切片間的關系是極為重要的。由于被研究的每一個組織切片的采集都是獨立進行的，切片間的空間信息沒有保存，所以這一工作在技術上還存在不少挑戰。當前用的較多的方法是通過交互式軟件實現手工配準[11]。一些自動化的方法雖然也有被提出，但在具體的實際操作中還是存在著復雜度較高的問題[12-13]。本研究的目標是優化自動化配準的方法，建立準確的三維組織學切片模型。對三維的組織學切片模型和MRM的T2圖進行配準，獲取Aβ斑塊的初期比較。

1 材料與方法

1.1 研究對象與數據獲取

在研究中，筆者使用了一只C57BL/6J小鼠作為對比鼠，一只PS/APP雙轉基因小鼠作為實驗鼠。小鼠的年齡均為18個月，此時PS /APP小鼠大腦中會有著明顯的Aβ斑塊。Bruker Biospec 4.7T/40 cm小動物MRM成像儀（Bruker BioSpin,Ettlingen，Germany）被用于進行圖像采集。首先通過徑向快速自旋回波掃描序列獲得128張連續T2加權像。掃描參數為：TR/TE =1000 ms/76.5 ms，層厚0.1 mm，體素大小= 0.1 mm×0.1 mm×0.1 mm，FOV為256 mm×256 mm。由于Aβ斑塊會導致T2的弛豫時間的降低[14]，需采集大腦的定量T2圖[15]。T2圖通過在k空間的中心使用特定的TE，而在k空間的外圍使用其他TE數值生成。掃描參數為：TR=2000 ms，層厚0.5 mm，TE分別為40、64、 88、112 ms。體素大小= 0.1 mm×0.1 mm×0.5 mm， FOV為256 mm×256 mm。T2圖通過將圖像強度與4個有效TE進行單指數衰減擬合生成，直接反映了組織的弛豫時間。Aβ斑塊會導致弛豫時間的降低，所以Aβ斑塊在T2圖中呈現為暗色斑點。

小鼠用10 mg/mL的戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔麻醉后，經左心室插入灌流針，先灌注冰凍無菌生理鹽水再灌注4%多聚甲醛。灌注同時切開小部分肝臟，斷頭取腦，放入同等濃度多聚甲醛外固定24 h。隨后，大腦將連續通過10%蔗糖6 h，20%蔗糖6 h，30%蔗糖6 h進行梯度脫水，最后在德國來卡2135型切片機中制成50 μm厚的冰凍切片。高分辨率尼康金相顯微鏡（Nikon Optiphot）和尼康數碼相機被用于組織切片的拍照。在低倍率放大時，由于顯微鏡內在原因造成的光照的不均勻非常明顯。因此，筆者先對沒有組織標本的載玻片進行拍照，以獲取光照掩模。反轉的光照掩模被用于校正圖像灰度。為了與MRM的中的Aβ斑塊進行對比，對組織切片通過硫代黃素S（1:1000）進行了染色處理（三維的T2加權像、三維的T2圖、二維的未染色的組織切片、二維的硫代黃素S染色的組織切片）。

1.2 圖像處理

圖像處理算法均在MATLAB環境下實現（MATLAB 2013a， MathWorks Inc.， Natick， MA， USA）。對于MRM圖像，先將圖像由原始文件格式轉換為NIFTI格式。非參數非均勻強度歸一化方法通過優化參數設計去除了MRM中的偏差場[16-17]。腦模板和自適應閾值的混合方法[18]被用于去除非腦組織。

對于組織切片圖像，首先將圖像由TIFF文件格式轉換為NIFTI格式。與MRM相比，光學顯微鏡連續切片所生成的圖像分辨率要高得多，可以識別細微的Aβ斑塊。然而，直接對二維組織切片的連續部分進行簡單堆疊并不能產生平滑的圖像。對于采集的組織切片數據，形變主要發生在冰凍切片過程中，包括全局平移和旋轉、部分的局部拉升和壓縮以及一些圖像偽影等。50 μm的切片厚度相對于組織的形狀改變可以忽略，采用下列步驟實現二維組織切片圖像的三維重建：① 對相鄰的二維組織切片采用標準化的互信息法進行仿射變換配準，消除全局形變，得到一個初步三維組織切片模型；② 采用標準化的互信息法配準三維組織切片模型與三維的MRM，得到組織切片與MRM的對應關系；③ 采用基于互信息的B樣條非剛體配準在二維尺度配準MRM（參照圖像）和切片圖像（移動圖像）；④ 返回到第二步，進行多次迭代，直到最終結果收斂，保留相應形變場信息。

將染色的組織切片與未染色的組織切片進行剛體配準，運用形變場信息將染色的組織切片配準到統一空間。將三維的T2加權像、三維的T2圖進行剛體配準，運用形變場信息將三維的T2圖配準到統一空間。現在四種圖像都被配準到統一空間，便于相互比較。

2 結果

在本研究采集的兩只小鼠腦組織切片圖像共計282張。原始圖像的大小為1280×1024（像素大小8.1 μm）。為了節省計算空間，與MRM圖像相比較，對其進行重采樣，圖像大小為320×256（像素大小32.5 μm）。整個處理過程是全自動的，在一臺標準PC（酷睿i5 3450，8 G內存）上耗時約30 min （其中約一半的時間是用于消除MRM圖像中的偏差場）。由于顯微鏡在透射光照射下對數字圖像的曝光不均勻，通過反轉的光照掩模可以消除這種不均勻（圖1）。通過三維重建算法重建的組織切片三維模型見圖2。三維模型可以去除大部分高頻噪音引起的合成形變，能夠形成比較光滑和容易辨認解剖結構，重建效果較好。

圖1 組織切片灰度校正

圖2 三維重建的組織切片模型

為了比較模型的精度，采用Jaccard相似度來衡量三維組織切片模型與MRM圖像的全腦體積的相似度。對于對比鼠，Jaccard相似度為0.972。而對于實驗鼠，Jaccard相似度為0.968。同時也可通過手動配準建模來比較三維組織切片模型與MRM圖像的全腦體積的相似度。對于手動配準建立的三維組織切片模型，Jaccard相似度為0.937和0.945。全自動建立的三維切片模型與MRM圖像的全腦體積具有較高相似度。

三維染色組織切片模型與三維T2圖配準后的結果顯示，兩者在Aβ斑塊的檢測上存在一定的對應關系。但不少染色組織切片上出現的Aβ斑塊在T2圖上沒有相對應的暗點出現（圖3）。這可能是由于組織切片的像素(8.3 μm)遠遠小于T2圖的像素（100 μm）。很多Aβ斑塊可能遠遠小于T2圖體素的體積，所以無法進行檢測。T2圖更適合于檢測較大的Aβ斑塊。

圖3 配準后的染色組織切片與T2圖

3 討論

本研究提出了一種建立三維組織切片模型的全自動方法，并將其與MRM三維圖像進行配準。該方法能夠較好地平衡配準精度和計算復雜度，但也存在一定的缺陷。例如，無論T2圖還是組織切片，層間距較像素分辨率要低。考慮到進行三維插值會對Aβ斑塊的檢測造成影響，筆者提出切片是相對較均勻這一假設。配準算法主要用于建立相鄰切片間的空間位置關系和修正二維切片內的形變，而對切片垂直方向的形變較為敏感。

4 結論

實驗結果顯示，盡管在染色組織切片與T2圖之間不存在對應的Aβ斑塊。但Aβ斑塊在染色組織切片與T2圖間卻有一定的對應關系。這說明用3D組織學切片模型來檢測小鼠大腦中的Aβ斑塊的方法是可行的。未來本研究的重點是建立一個大型數據庫，進一步研究MRM圖像與組織學切片中Aβ斑塊的關系。另外，相對于組織切片的Aβ斑塊的研究，MRM的Aβ斑塊檢測還處于一個早期階段。需要建立一種全自動算法，用來檢測MRM的T2圖中的Aβ斑塊。這項研究可以加深對AD中Aβ斑塊的產生、沉積和清除的了解。隨著AD研究的重心正在逐漸轉向AD的前期甚至無癥狀的早期診斷，通過神經影像技術來對轉基因小鼠大腦中的Aβ斑塊進行監測，可以幫助建立早期生物標志物，所以必將發展成為對抗AD的治療方法。

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Research of Magnetic Resonance Microscopy and Histological Section on Beta-Amyloid Plaques in PS/APP Transgenic Mice

LIN Lan, FU Zhen-rong, ZHANG Bai-wen, ZHOU Zhu-huang, GAO Hong-jian, WU Shui-cai
College of Life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China

ObjectiveTo investigate the relationship between magnetic resonance microscopy (MRM) T2 map associated with Aβ plaques and their histology on dual transgenic PS/APP mouse brain.MethodsThe paper proposed an efficient, automated image-processing pipeline that used unstained sections to reconstruct a 3D brain model from 2D histological sections and further registered these with the corresponding 3D MRM. The imaging registration was a multistep registration procedure that first aligned the neighboring 2D slices and then iteratively performed 2D and 3D registration.ResultsThe registration pipeline can accurately register the 2D histology sections and 3D MRM. Some Aβ plaques can be found both in stained histology and MRM.ConclusionThis research monitored the Aβ plaques in PS/APP transgenic mice through neuroimaging technology, which can facilitate the understanding of the generation, deposition, and removal of Aβ plaques in Alzheimer’s disease.

TP273

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.02.007

1674-1633(2016)02-0031-03

2015-09-15

北京市自然科學基金（7143171）資助。

林嵐，副教授。

通訊作者郵箱：lanlin@bjut.edu.cn

Abstract:: β-amyloid protein; magnetic resonance microscopy; Alzheimer’s disease