高效液相色譜法測定復方混懸滴眼液中苯扎氯銨含量

楊龍華，宿 潔，陳 濤，盧京光

（山東省青島市食品藥品檢驗檢測中心，山東 青島 266071)

高效液相色譜法測定復方混懸滴眼液中苯扎氯銨含量

楊龍華，宿 潔，陳 濤，盧京光

（山東省青島市食品藥品檢驗檢測中心，山東 青島 266071)

目的 建立測定氯替潑諾妥布霉素復方混懸滴眼液中防腐劑苯扎氯銨含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 色譜柱為Waters Spherisorb S5 CN柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流動相為0．1%磷酸溶液－乙腈－四氫呋喃（52∶39∶15），流速為1．5 mL／min，檢測波長為216 nm，柱溫為30℃。結果 苯扎氯銨質量濃度在0．04～0．20 g／L（r＝0．999 9，n＝5）范圍內與峰面積線性關系良好，平均回收率為100．22%，RSD為0．59%(n＝9）。結論 該方法簡便、靈敏，色譜峰分離度良好，結果準確、可靠，可用于氯替潑諾妥布霉素混懸滴眼液的質量控制。

高效液相色譜法；苯扎氯銨；混懸滴眼液；防腐劑；含量測定

氯替潑諾妥布霉素復方混懸滴眼液臨床主要用于治療對甾體激素敏感及細菌感染的眼部炎癥。該復方混懸滴眼液中聯合苯扎氯銨和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）作為防腐系統，以提高該制劑的穩定性，已有文獻對該制劑中的EDTA含量測定方法進行了研究[1]。苯扎氯銨是由3種正烷烴基（n－C12H25，n－C14H29，n－C16H33）取代二甲基芐基氯化銨組成的同系物混合物，在水溶液中離解成陽離子活性基團，具有殺菌作用，3種同系物的殺菌特性不同。苯扎氯銨為國內有藥用標準的常用防腐劑，眼科常用量0．003%～0．020%。在0．1%濃度下，苯扎氯銨可引起變態反應性結膜炎、視力減退、接觸性皮炎等不良反應，故控制氯替潑諾妥布霉素混懸滴眼液中苯扎氯銨的含量十分必要。目前，已有文獻報道，單方滴眼液中苯扎氯銨的含量測定方法[2－3]，但無復方混懸劑中苯扎氯銨含量測定方法的報道。本研究中建立了測定氯替潑諾妥布霉素混懸滴眼液中苯扎氯銨含量的反相高效液相色譜(RP－HPLC)法，現報道如下。

1 儀器與試藥

LC－2010C型高效液相色譜－紫外儀和CLASS VP型色譜工作站（日本島津公司）。苯扎氯銨（中國藥品生物制品檢定所，批號為061067524A，標示量為100 g／L，含量為99．10%）；氯替潑諾妥布霉素混懸滴眼液（美國博士倫股份有限公司，批號為分別為107781，117621，127001）；乙腈、四氫呋喃、氯丁烷為色譜純；水為超純水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Waters Spherisorb S5 CN柱（250 mm× 4．6 mm，5 μm）；流動相：0．1%磷酸溶液－乙腈－四氫呋喃（52∶39∶15，用1 mol／L氫氧化鈉溶液調節pH至3．5，每2 000 mL流動相溶液加氯丁烷25 mL）；流速：1．5 mL／min；檢測波長：216 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。取對照品溶液和供試品溶液適量，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。對照品溶液色譜峰流出順序為 C12，C14，C16同系物；C12和 C14同系物分離度為4．5；C12同系物和樣品基質峰（相對于C12同系物峰的相對保留時間約為0．14）分離度為14．9。

2．2 溶液制備

精密量取苯扎氯銨對照品1．0mL，置100mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備溶液(0．991 0 g／L)。量取對照品貯備液適量，加水制成每1 mL中約含苯扎氯銨0．1 mg的溶液，作為對照品溶液。取氯替潑諾妥布霉素混懸滴眼液（批號為 107781）輕輕攪拌3 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學考察

線性關系考察：精密量取2．2項下對照品貯備溶液（0．991 0 g／L）2．0，4．0，5．0，8．0，10．0 mL，分別置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得標準曲線溶液(苯扎氯銨質量濃度分別為 0．039 64，0．079 28，0．099 10，0．158 56，0．198 2 g／L)，精密量取各混合標準曲線溶液20 μL，按擬訂色譜條件進樣分析，以各標準曲線溶液質量濃度（C，g／L）為縱坐標、C12，C14，C163個同系物峰面積（A）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程C＝9．073 0×10－8A＋3．659 6×10－5，r＝0．999 9 (n＝5）。結果表明，苯扎氯銨質量濃度在0．04～0．20 g／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次進行測定。結果苯扎氯銨色譜峰面積的RSD為0．1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定峰面積。結果苯扎氯銨色譜峰面積的 RSD為0．6%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：精密量取對照品貯備液（0．9910 g／L）0．25，0．5，1．0 mL各3份，分別置9個10 mL容量瓶中，并分別加入已知含量且經攪拌過濾的混懸滴眼液樣品5．0 mL（批號為117621，標示量為0．1 g／L，含量為99．84%），加水稀釋至刻度，搖勻，依法進樣測定，計算回收率。結果見表1。

2．4 樣品含量測定

取樣品3批，分別輕輕攪拌3 min后過濾，取濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，將供試品溶液的峰面積代入標準曲線方程計算含量。結果見表2。

表1 苯扎氯銨加樣回收試驗結果（n＝9）

表2 樣品含量測定結果（%）

3 討論

檢測波長選擇：以水作為空白溶液，在200～300 nm波長范圍內掃描，結果在208，263 nm波長處均有最大吸收。因苯扎氯銨在滴眼液中含量較低，在263 nm波長測定其響應值較低，而208 nm波長接近末端吸收，檢出雜質較多，影響苯扎氯銨同系物色譜峰與相鄰色譜峰的分離度。本試驗最終選擇216 nm波長作為檢測波長，可使苯扎氯銨同系物色譜峰與相鄰色譜峰的分離度達到要求，并能準確測定苯扎氯銨的含量。

流速和柱溫選擇：苯扎氯銨是同系物組成的混合物，有多個主峰，為了利于快速分析，對流速和柱溫進行了優化，最終選擇流速為1．5 mL／min，柱溫為30℃。

計算方法選擇：苯扎氯銨對照品說明書未給出各同系物的含量比例，僅給出同系物（n－C12H25，n－C14H29，n－C16H33）標示量為100 g／L，含量為99．10%，因此按外標法選擇以C12，C14，C163個同系物峰面積之和計算混懸滴眼液中苯扎氯銨的含量。雖然對照品溶液和供試品溶液色譜圖中均出現C18色譜峰，但含量低于0．1%，因此計算時可忽略不計。

[1]薛 琦，楊龍華．反相離子對高效液相色譜法測定混懸滴眼液中乙二胺四乙酸二鈉含量[J]．中國藥業，2012，21（1）：24－25．

[2]韓文芳，韓保萍，朱啟登，等．HPLC測定鹽酸奧洛他定滴眼液中苯扎氯銨的含量[J]．食品與藥品，2010，11（12）：425－427．

[3]朱樣根，龔楚良．右旋糖酐70甘油滴眼液中苯扎氯銨含量測定方法研究[J]．藥物分析，2012，32（3）：461－463．

Determination of Benzalkonium Chloride in Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension by HPLC

Yang Longhua，Su Jie，Chen Tao，Lu Jingguang
（Qingdao Institute for Food and Drug Control，Qingdao，Shandong，China 266071）

Objective To establish an HPLC method for the determination of benzalkonium chloride in Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension．Methods After being filtrated，samples were separated by HPLC on a Waters Spherisorb S5 CN column（250 mm× 4．6 mm，5 μm）．The mobile phase was 0．1% phosphoric acid water solution－ acetonitrile－ tetrahydrofuran（52∶39∶15）．The detection wavelength was 216 nm．The flowing speed was 1．5 mL／min．The column temperature was 30℃．Results The mass concentration of benzalkonium chloride was in good linear relationship with the peak area in the range of 0．04－0．20 g／L（r＝0．999 9，n＝5），and the average recovery rate was 100．22%，RSD＝0．59%(n＝9）．Conclusion The method is sensitive，accurate and convenient with good resolution，it can be applied to control the quality of Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension．

HPLC；benzalkonium chloride；Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension；antiseptic;content determination

R927．2；R988．1

A

1006－4931(2016)02－0070－03

楊龍華（1979－），女，碩士研究生，主管藥師，研究方向為藥物質量分析方法，（電子信箱）ylh＿qd＠126．com。

2015－07－05)