柿葉總黃酮的初步質量研究

黃順旺，喬金為，左亞鋒，李 正，陳師農，孫 備，吳德玲，李玲芝，宋少江

（1．安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230022； 2．安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230031； 3．沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016）

柿葉總黃酮的初步質量研究

黃順旺1，3，喬金為2，左亞鋒2，李 正2，陳師農1，孫 備1，吳德玲2，李玲芝3，宋少江3

（1．安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230022； 2．安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230031； 3．沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016）

目的 建立柿葉提取物中總黃酮的質量研究方法。方法 用薄層色譜法對總黃酮中的蘆丁、槲皮素、山柰酚進行定性鑒別；以蘆丁為標準品，用分光光度法測定總黃酮的含量；用高效液相色譜法對總黃酮的水解苷元槲皮素、山柰酚進行含量測定。結果 薄層鑒別的色譜斑點清晰。供試品溶液最大吸收波長為 410 nm。槲皮素質量濃度在 9．6～57．6 g／mL范圍內與峰面積呈良好線性關系（r＝0．999 8），平均回收率為99．09%，RSD為0．47%（n＝6）。山柰酚質量濃度在9．28～55．68 g／mL范圍內與峰面積呈良好線性關系（r＝0．999 8），平均回收率為99．03%，RSD為0．55%（n＝6）。結論 該方法簡便、快速，重復性及穩定性均較好，可用于柿葉提取物中總黃酮的初步質量控制。

柿葉總黃酮；蘆丁；槲皮素；山柰酚；薄層色譜；分光光度法；高效液相色譜法

柿葉為柿科柿屬植物柿 Diospyros kaki Thunb．的新鮮或干燥葉，收載于湖南、廣東、廣西藥材標準中，化學成分較復雜，主要含有黃酮、三萜、酚類等化合物。其中黃酮類大多以苷的形式存在，具有抗心肌缺血、保護血管和腦缺血性神經細胞、耐缺氧、改善血液循環等多種生物活性。柿是我國南北各地普遍栽培的食用品種，分布廣泛。目前，柿葉的開發利用主要是加工成柿葉茶等多種功能保健食品，日本是世界上最早開發利用柿葉茶的國家，臨床藥品“kaki yo”可用于治療高血壓，在印度傳統醫藥中也作利尿劑、止血劑[1]。通過查詢國家食品藥品監督管理總局(CFDA)網站得知，國內有7家藥企生產柿葉乙酸乙酯浸出物制成的中成藥腦心清片和膠囊。目前，國內對柿葉中總黃酮研究的報道較多，但關于質量標準研究仍待深入。因此，筆者對柿葉有效部位中總黃酮的質量控制進行了研究，現報道如下。

1 儀器與試藥

硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，100 mm×100 mm，供薄層層析用）；TU－1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；LC－10AT型高效液相色譜(HPLC)儀（日本島津公司)，包括 SPD－10Avp型紫外檢測器，LC－10Atvp型溶劑輸送泵，N－2000型雙通道色譜工作站；KQ－250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AR1140型電子天平（十萬分之一，上海加惠儀器儀表有限公司）；真空干燥箱（上海越眾儀器設備有限公司）；HHS型電熱數顯水浴鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。柿葉藥材購自安徽普仁中藥飲片有限公司，經沈陽藥科大學中藥學院路金才教授鑒定為柿科柿屬植物柿 Diospyros kaki Thunb．的葉；蘆丁對照品（批號為100080－200707）、槲皮素對照品（批號為 10081－9905）、山柰酚對照品（批號為0861－200002），供含量測定用，均購自中國食品藥品檢定研究院；柿葉提取物總黃酮樣品（批號為 140911，140912，140913）均為我院天然藥化室自制；甲醇、磷酸為色譜純，水為重蒸餾水，濃鹽酸、AlCl3·6H2O等其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 薄層色譜（TLC）鑒別[2－3]

取3批柿葉總黃酮樣品5 mg（本試驗中均采用減重法稱量），研細，加甲醇5 mL，超聲溶解，得供試品溶液。另取柿葉總黃酮樣品10 mg，加甲醇適量，完全溶解，加36%濃鹽酸適量，使鹽酸終濃度為2 mol／L，搖勻，90℃回流2 h，得水解供試品溶液（質量濃度約為1 g／L）。另取蘆丁、槲皮素、山柰酚對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL約含0．3 mg的溶液，得對照品溶液。取以上對照品溶液各0．5 mL混合，得混合對照品溶液。吸取上述6種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－甲酸乙酯－甲酸（6∶6．5∶1．5）為展開劑，取出，晾干。噴以2%AlCl3乙醇溶液，在105℃加熱30 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，與3個對照品溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。水解供試品溶液色譜中，在與槲皮素、山柰酚對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，在與蘆丁對照品溶液色譜相應位置上則無斑點。見圖1。

圖1 薄層色譜圖

2．2 總黃酮含量測定(分光光度法)[2，4]

溶液制備：精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品4．6 mg于5 mL容量瓶中，50%乙醇超聲溶解，定容至刻度，得0．92 g／L對照品溶液。

線性關系考察：取蘆丁對照品溶液1．0 mL，置25 mL容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，分別取1．0，2．0，2．5，3．0，3．5，4．0 mL，置 10 mL容量瓶中，加入0．1 mol／L AlCl3·6H2O（稱取 0．483 g的 AlCl3·6H2O溶于20 mL的重蒸餾水中，超聲30 min即得）1．0 mL，搖勻，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，40 min后于410 nm波長處測定吸光度（A）。以質量濃度（C，μg／mL）對 A進行線性回歸，得回歸方程 A＝0．025 C＋0．003 8，r＝0．999 7。結果表明，蘆丁質量濃度在3．68～14．72 μg／mL與峰面積呈良好線性關系。

含量測定：分別取 3批總黃酮樣品 16．8，17．1，16．5 mg，置100 mL容量瓶中，加入50%乙醇超聲溶解，定容至刻度，得 0．168，0．171，0．165 g／L的供試品溶液。分別取供試品1 mL，置10 mL容量瓶中，加0．1 mol／L AlCl3·6H2O 1．0 mL，搖勻，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，40 min后于410 nm波長處測定吸光度，計算含量。結果見表2。

2．3 總黃酮中槲皮素和山柰酚含量測定[3，5]

2．3．1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：COSMOSIL5C18－MS－Ⅱ柱（250mm×4．6mm，5 μm）；流動相：甲醇－0．4%磷酸溶液（58∶42）；流速：1．0 mL／min；檢測波長：360 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。保留時間：槲皮素約為9 min，山柰酚約為14 min，理論板數應不低于5 000。供試品溶液色譜圖中，槲皮素和山柰酚與前面相鄰的雜質峰分離度（R）分別為1．731和 7．972（n＝3），拖尾因子（T）分別為 1．03和 0．98（n＝3），均符合2010年版《中國藥典（一部）》規定。色譜圖見圖2。

圖2 柿葉提取物高效液相色譜圖

2．3．2 溶液制備

稱取真空干燥至恒重的槲皮素對照品6．0 mg，山柰酚對照品5．8 mg，精密稱定，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為槲皮素、山柰酚對照品貯備液（質量濃度為0．240，0．232 g／L）；精密量取上述貯備液各3 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得混合對照品溶液(槲皮素、山柰酚質量濃度分別為0．028 8，0．027 8 g／L)。取柿葉提取物樣品（批號為140911）適量，研細，取約100 mg，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加甲醇20 mL，超聲使其完全溶解，加入36%濃鹽酸約4 mL，使鹽酸終濃度為2 mol／L，搖勻，90℃水浴回流2 h，冷卻，定量轉移至250 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2．3．3 方法學考察

定量限測定：取對照品溶液（槲皮素9．6 μg／mL、山柰酚9．28 μg／mL），不斷稀釋，按照信噪比不得小于10計算，得定量限，槲皮素為1．92 μg／mL，山柰酚為1．86 μg／mL。

線性關系考察：精密量取槲皮素、山柰酚對照品貯備液各 1．0，2．0，3．0，4．0，5．0，6．0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，依法測定，以對照品質量濃度（X）為橫坐標、峰面積值（Y）為縱坐標進行線性回歸。得回歸方程槲皮素為 Y＝54 028 X－16 536，r＝0．999 8（n＝6），質量濃度在 9．6～57．6 μg／mL范圍內與峰面積呈良好線性關系；山柰酚為 Y＝58 650 X－5 292．6，r＝0．999 8（n＝6），質量濃度在9．28～55．68 μg／mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗：精密量取同一質量濃度槲皮素、山柰酚混合對照品溶液10 μL，依法測定，連續測定6次。結果槲皮素、山柰酚峰面積的 RSD分別為 0．87%，0．68%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密稱取同一批樣品（批號為140911），依法制備供試品溶液，平行制備6份。分別精密量取供試品溶液、對照品溶液（槲皮素、山柰酚對照品濃度分別為0．028 8 g／L和0．027 8 g／L）各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。結果槲皮素、山柰酚含量的 RSD分別為1．52%和1．81%（n＝6），表明該方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下的同一供試品（批號為140911）溶液，分別于0，2，4，6，8 h時進樣10 μL，記錄色譜圖。結果槲皮素、山柰酚峰面積基本不變，RSD分別為1．60%和1．65%（n＝5），表明供試品溶液在8h內穩定。

加樣回收試驗：取供試品（批號為140911）細粉約50 mg，精密稱定，共6份，分別置250 mL容量瓶中，分別精密加入混合對照品溶液（槲皮素4．800 g／L和山柰酚5．594 g／L）0．5，1．0，1．5 mL，每個質量濃度平行制備2份，再分別加甲醇至刻度，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液，依法測定。結果見表1。

2．3．4 含量測定

經自制 3批柿葉提取物樣品（批號為 140911，140912，140913），按供試品溶液的制備項下方法制備供試品溶液，平行測定2次。結果見表2。

3 討論

提取物的制備方法：柿葉產于安徽蚌埠，曬干，切斷，采用70%乙醇煎煮，煎液過濾，濾液濃縮至無醇味，得清膏，石油醚（60～90℃）萃取（脫脂和色素等），再用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯后的干粉與聚酰胺型樹脂拌樣，上聚酰胺型大孔樹脂，乙醇洗脫，冷凍干燥，即得總黃酮提取物。

表1 槲皮素、山柰酚加樣回收試驗結果（n＝6）

表2 3批樣品含量測定結果

TLC鑒別：由圖1可知，供試品溶液色譜中除槲皮素、山柰酚和蘆丁外，尚有多個斑點，因無對照品，故無法一一對應鑒別；水解供試品溶液色譜中，除槲皮素、山柰酚主斑點外，還分布有個別斑點，可能為其他苷元，同時未檢測到蘆丁，分析原因可能為其已水解。

總黃酮含量測定波長的選擇：精密吸取蘆丁對照品溶液0．1 mL和供試品溶液適量，置10 mL容量瓶中，分別加入 0．1 mol／L AlCl3·6H2O 1．0 mL，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，放置 40 min，隨行空白校零，于190～700 nm范圍內掃描測定吸收光譜。蘆丁對照品溶液的 λmax為 410 nm，3個樣品溶液的λmax均在400～410 nm，故選擇AlCl3顯色后的410 nm波長。

總黃酮中槲皮素和山柰酚檢測波長的選擇：取槲皮素和山柰酚對照品適量，加甲醇溶解，稀釋至一定刻度，照紫外可見分光光度法[2010年版《中國藥典（一部）》]附錄ⅤA，以甲醇為空白，在200～500 nm波長范圍掃描，結果于260 nm和360 nm均有較強吸收，但360 nm處樣品中其他成分干擾較小。故選擇360 nm作為檢測波長。

HPLC指標成分的選擇[6]：目前從柿葉中分離得到的黃酮類化合物有十幾種成分，其中主要含有槲皮素和山柰酚苷元及其單、雙糖苷類，如蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、山柰酚－3－O－α－L－吡喃鼠李糖苷、槲皮素－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷等。由圖1可知，總黃酮進行酸水解后，測定水解后主成分槲皮素（C15H10O7）和山柰酚（C15H10O6）的含量，故選擇對兩者含量測定作為控制提取物質量的有效方法。

流動相的選擇：參照考文獻[5]，采用流動相甲醇－0．4%磷酸溶液（50∶50），結果槲皮素和山柰酚的出峰時間較長，檢測1次大約需要40 min，后調整流動相為58∶42，出峰時間均在20 min內，故選擇后者為流動相。

[1]姜紅波，趙衛星，馮國棟，等．柿葉的主要有效成分及藥理作用研究進展[J]．化工時刊，2010，24（6）：38－44．

[2]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄30．

[3]羅 杰，貝偉劍，徐 騰，等．腦心清片質量標準的研究[J]．中國新藥雜志，2004，13（7）：625－627．

[4]張秀梅，曾祖平，王永紅．柿葉總黃酮提取工藝的研究[J]．時珍國醫國藥，2008，19（1）：35－36．

[5]Chen G，Wei SH，Huang J，et al．A novel C－glycosylflavone from the leaves of Diospyros kaki[J]．Journal of Asian Natural Products Research，2009，11（6）：503－507．

[6]貝偉劍，羅 杰，吳愛鑾，等．HPLC法測定柿葉浸膏中槲皮素和山柰酚[J]．中草藥，2005，36（7）：1 014－1 015．

Quality Standard of Persimmon Leaf Flavonoids

Huang Shunwang1，3，Qiao Jinwei2，Zuo Yafeng2，Li Zheng2，Chen Shinong1，Sun Bei1，Wu Deling2，Li Lingzhi3，Song Shaojiang3
（1．Anhui Institute of Food and Drug Control，Hefei，Anhui，China 230022； 2．Anhui University of TCM，Hefei，Anhui，China 230031；3．School of Chinese Materia Medicia，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang，Liaoning，China 110016）

Objective To establish the qualitystandard of persimmon leaf flavonoids．M ethods To qualitatively identify therutin，kaempferol and quercetin in the total flavonoid by TLC method；the total flavonoid was determined by spectrophotometry with rutin as standard material．The content of quercetin and kaempferol was determined by HPLC．Results The characteristic identification by TLC was distinct and highly specific．The absorbance of total flavonoid was measured at 410 nm．The quercetin showed a good linear in the range of 9．6－57．6 μg／mL（r＝0．999 8），the average recovery was 99．09%，and RSD was 0．47%（n＝6）．The kaempferol showed a good linear relationship with the peak area in the range of9．28－55．68 μg／mL（r＝0．999 8），the average recovery was 99．03%，and RSD was 0．55%（n＝6）．Conclusion The method is simple and rapid，and the reproducibility and stability are good，it is suitable for the quality control of persimmon leaf flavonoids．

persimmon leaf flavonoids；quercetin；kaempferol；TLC；spectrophotometry；HPLC

R284．1；R282．71

A

1006－4931(2016)02－0034－04

黃順旺，男，副主任藥師，主要從事新藥研究工作，（電子信箱）huangsw5503＠163．com；宋少江，男，博士研究生導師，主要從事天然產物活性成分和質量控制度結構優化研究工作，本文通訊作者，（電話）024－23986510。

2015－02－05；

2015－08－10)