內(nèi)蒙古自然發(fā)酵綿羊奶油中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)勢(shì)菌群q-PCR定量分析

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

內(nèi)蒙古自然發(fā)酵綿羊奶油中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)勢(shì)菌群q-PCR定量分析

劉紅新，德亮亮，陳紅霞，劉文俊，孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對(duì)內(nèi)蒙古不同地區(qū)的12份綿羊奶油樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離純化，運(yùn)用16S rDNA序列分析方法進(jìn)行屬種鑒定，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（q-PCR）技術(shù)對(duì)包頭地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量進(jìn)行了定量研究。分離鑒定結(jié)果表明三個(gè)地區(qū)綿羊發(fā)酵奶油中分離鑒定的44株乳酸菌，其中Lactococcus lactis subsp.Lactis為優(yōu)勢(shì)菌群。q-PCR定量結(jié)果表明3種優(yōu)勢(shì)菌屬的數(shù)量關(guān)系為L(zhǎng)ac.Lactis.subsp.lactis＞L.plantarum＞Leu.Mesenteroides。

乳酸菌；分離鑒定；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)；天然發(fā)酵奶油

0 引言

自然發(fā)酵奶油（Naturally fermented cream），蒙古語(yǔ)又稱Zhouhei，是從牛奶、羊奶中提取的黃色或白色脂肪性半固體食品[1]，富含人體所需多種脂肪酸及有益脂類，賦予乳制品良好的風(fēng)味，改善乳制品的口感[2]。然而，關(guān)于發(fā)酵奶油的系統(tǒng)性研究還較少，特別是對(duì)自然發(fā)酵羊奶油中微生物的研究更少。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quanti?tative polymerase chain reaction,q-PCR）是將普通PCR和光譜分析、實(shí)時(shí)檢測(cè)等手段巧妙結(jié)合到一起的一項(xiàng)技術(shù)[3]。在乳酸菌定量分析中較傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)具有快速、準(zhǔn)確、高效等[4]優(yōu)勢(shì)。

本研究運(yùn)用16S rDNA序列分析方法對(duì)內(nèi)蒙古不同地區(qū)綿羊奶油樣品中的乳酸菌進(jìn)行種屬鑒定，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行分析與研究，不僅豐富中國(guó)的乳制品市場(chǎng)，也為乳酸菌資源的開(kāi)發(fā)與利用提供有力依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料與試劑

本研究中12份奶油樣品由實(shí)驗(yàn)室的研究人員于2014年6月14日-2014年6月17日在內(nèi)蒙古鄂爾多斯、包頭、巴彥淖爾三個(gè)地區(qū)采集（采集條件：溫度為18～23℃，pH值在4.5以下，2～6 d發(fā)酵）。樣品采集后低溫保存，于-80℃超低溫保藏，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

菌株分離、傳代培養(yǎng)基分別為MRS固體和MRS液體培養(yǎng)基分離、純化乳桿菌；M17固體和M17液體培養(yǎng)基用于分離、純化、培養(yǎng)乳球菌。

實(shí)驗(yàn)所用試劑：PBS保護(hù)液；PBS緩沖液，所用試劑級(jí)緩沖液均參照文獻(xiàn)[5]要求配制；DNA提取試劑，DNA片段膠回收純化試劑，PCR擴(kuò)增及凝膠電泳所用試劑和酶類和Marker。

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增引物序列參考細(xì)菌通用引物序列[6]并進(jìn)行了完善[7]。用于菌株q-PCR特異性引物采用Primer5軟件合成，引物序列如表1所示。

表1 q-PCR特異性引物信息

1.2儀器與設(shè)備

便攜式冰箱、溫度計(jì)、便攜式PH計(jì)、采樣箱，ZHJH-C1214C型超凈工作臺(tái)；TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī)；HWS28型電熱恒溫水浴鍋；AR2202CN型電子天平；KDC-1044型低速離心機(jī)；LRH-250生化培養(yǎng)箱；BX50型光學(xué)顯微鏡；HA-300M型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器；SP-650型全自動(dòng)高壓干熱滅菌器；WD-9405B型水平搖床；LL-6SFPY型真空冷凍干燥機(jī)；PTC-200梯度基因擴(kuò)增儀；DYY-12型電泳儀；GDS-8000型凝膠成像儀；ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)等。

1.3樣品采集及乳酸菌分離、鑒定

1.3.1 樣品采集

本研究在采集奶油樣品時(shí)采用直接取樣法。將樣品充分混勻，吸取樣品至裝有滅菌中和劑（內(nèi)含0.5 g，CaCO3/淀粉=1/50，質(zhì)量比）的無(wú)菌螺口凍存管中，混勻后標(biāo)記樣品號(hào)并作記錄，封口保存。最后將采集的樣品置于4℃便攜式冰箱中以維持其低溫狀態(tài)，進(jìn)行乳酸菌的分離純化等試驗(yàn)。

1.3.2 樣品中乳酸菌的計(jì)數(shù)和分離

乳酸菌的活菌計(jì)數(shù)，采用傾注培養(yǎng)法[8]。將奶油樣品梯度稀釋（10-4，10-5，10-6），后涂于MRS和M17固體培養(yǎng)基上，隨機(jī)選擇不同菌落形態(tài)的單菌落進(jìn)行乳酸菌的初步分析，選取過(guò)氧化氫陰性、革蘭氏陽(yáng)性的純培養(yǎng)物，將此培養(yǎng)物暫定為乳酸菌，然后進(jìn)一步運(yùn)用16S rDNA序列分析方法進(jìn)行屬種鑒定[9]。

1.3.3 16S rDNA序列測(cè)序鑒定

采用液氮反復(fù)凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組DNA[10]，再用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度以及OD260/280值。

PCR擴(kuò)增體系：5 μL 10×EasyTaq Buffer(Mg2+)；4 μL High Pure dNTPs（2.5 mMol/L）；1.5 μL引物FA-27F（10 mmol/L）；1.5 μL引物RA-1495R（10 mmol/L）；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA模板（100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃末端延伸10 min。

擴(kuò)增完畢后，取約2 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若在1 500 bp處有清晰的擴(kuò)增條帶且無(wú)拖尾、彌散現(xiàn)象，則PCR擴(kuò)增成功。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行純化和DNA測(cè)序。將測(cè)序得到的DNA序列運(yùn)用SeqMan（DNAStar 5.01）軟件進(jìn)行序列拼接后，再利用NCBI中的BLAST將拼接好的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已鑒定的乳酸菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析[11]，將待鑒定菌株序列與同源性最高的模式菌株序列應(yīng)用MEGA 5.0（http://www.megasoftware.net）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行遺傳進(jìn)化研究。

1.4樣品中優(yōu)勢(shì)菌群的q-PCR定量分析

1.4.1 綿羊奶油樣品及標(biāo)準(zhǔn)菌株宏基因組DNA的提取

綿羊奶油樣品宏基因組DNA的提取采用玻璃珠吸附法，具體方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]。將提取的DNA原液稀釋至100 ng/μ L左右，作為備用。標(biāo)準(zhǔn)菌株L. plantarum(ATCC14931)、Leu.mesenteroides(AS1.544)、Lac.lactis subsp.lactis(ATCC19435)用液體MRS培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，收集菌體，采用SDS-CTAB液氮反復(fù)凍融法提取標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA[13]，并檢測(cè)其純度和濃度。采用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)品DNA原液的OD值和濃度，并對(duì)其進(jìn)行十倍稀釋。

以模式菌株DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)菌株的10-1～10-8梯度稀釋液為模板構(gòu)建q-PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。，以綿羊奶油樣品的宏基因組DNA稀釋液為樣品模板，進(jìn)行樣品中優(yōu)勢(shì)菌群-q-PCR定量分析，設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，并以ddH2O為陰性對(duì)照模板，采用特異性引物按照表2中的定量PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增方法在實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，利用StepOne v2.3軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線為依據(jù)，對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌屬菌種進(jìn)行定量分析。

表2 q-PCR擴(kuò)增體系

實(shí)時(shí)定量PCR采用兩步法，具體擴(kuò)增條件如下：預(yù)熱階段：95℃20 s；循環(huán)階段：95℃、20 s預(yù)變性，然后95℃變性5 s，退火40 s，72℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增階段：95℃（15 s），75℃（1 min）。

2 結(jié)果與分析

2.1地區(qū)綿羊奶油樣品中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果

內(nèi)蒙古不同地區(qū)綿羊奶油樣品中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果如表3所示。

表3 內(nèi)蒙古不同地區(qū)綿羊奶油中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果

內(nèi)蒙古不同地區(qū)（包頭、巴彥淖爾、鄂爾多斯）奶油中乳酸菌的活菌數(shù)見(jiàn)表3，從中可以看出，本研究奶油樣品活菌數(shù)均大于107mL-1，在7.07～9.99 mL-1（對(duì)數(shù)值）之間,平均值為(8.38±0.09)mL-1（對(duì)數(shù)值）。可見(jiàn)內(nèi)蒙古三個(gè)地區(qū)的綿羊奶油制品新鮮度較高，菌株存活能力較強(qiáng)，有利于下一步的分離鑒定及研究。張哲等[14]人對(duì)俄羅斯卡爾梅克地區(qū)酸奶油樣品進(jìn)行研究，其中乳酸菌活菌數(shù)在7.30～8.62 mL-1（對(duì)數(shù)值）之間。張文羿等[15]對(duì)11份青海海西州酸山羊奶中的乳酸菌進(jìn)行研究，活菌數(shù)在8.40～9.48 mL-1（對(duì)數(shù)值）之間。張冬蕾[16]等人對(duì)內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)酸羊奶進(jìn)行分析，活菌數(shù)在7.78～9.84 mL-1（對(duì)數(shù)值）之間。包秋華等[17]對(duì)13份云南酸山羊奶的研究表明其乳酸菌活菌數(shù)為8.32～10.34 mL-1（對(duì)數(shù)值）之間。由此可見(jiàn)，采樣地點(diǎn)不同，其中乳酸菌活菌數(shù)量存在差異。即使同一地區(qū)采樣，隨著發(fā)酵和貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，自然發(fā)酵乳制品中微生物乳酸菌種屬和數(shù)量也會(huì)有變化。

2.2乳酸菌分離鑒定結(jié)果

根據(jù)乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征及理化性質(zhì)[18]初步將44株菌定為乳酸菌。

2.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

DNA濃度和OD260/280值的測(cè)定：提取44株乳酸菌的DNA并測(cè)其濃度以及OD260/280值，OD260/280值在1.8～2.0之間即為純DNA樣品。將DNA原液稀釋至濃度為100 ng/μL后進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，如圖1可以觀察到在大約1 500 bp的位置處有一條清晰明亮的條帶，無(wú)拖尾、彌散現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，說(shuō)明分析菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增成功。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送于上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 部分分離株16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖1中，1～23為部分分離株16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物；M為DL 2000 DNA Markers。

2.2.2 16S rRNA基因同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，若同源性高于99%則可直接將其歸為此種模式株菌種，選取部分具有代表性的菌株用MEGA 5.0（http://www.megas?oftware.net）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分離株與模式株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示（選取部分作圖）。

圖2 內(nèi)蒙古不同地區(qū)代表性分離株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖2可以看出，所有分離株集中為桿菌，IMAU11449(KP764065)與模式菌Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei DSM 5622T(D79212)聚為一類，同源性達(dá)99%以上，將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus paracasei subsp.Pa?racasei。IMAU11533(KP763948)與模式菌Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469T(D16552)聚為一類，同源性達(dá)99%以上，因此將歸其為 Lactobacillus rhamnosus。IMAU11532(KP763910)與模式菌Lactobacillus planta?rum ATCC 14917T(AJ965482)聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum。IMAU11447 (KP763888)與模式菌Lactobacillus helveticus(AM113779)聚為一類，同源性達(dá)99%以上，故鑒定為L(zhǎng)actobacillus helveticus。IMAU11312(KP764111)與模式菌Lactococ?cus lactis subsp.lactis ATCC 19435T(AB100803)聚為一類，同源性達(dá)99%以上，故將其鑒定為L(zhǎng)actococcus lactis subsp.lactis。IMAU11410(KP764063)與模式菌Leuco?nostoc pseudomesenteroides ATCC12291T(AB023237)聚為一類，同源性為99%以上，故鑒定為L(zhǎng)euconostoc pseudo?mesenteroides。IMAU11541(KP764027)與模式菌Leuco?nostoc mesenteroides NCFB 529T(AB023244)聚為一類，同源性達(dá)99%以上，故將其歸為L(zhǎng)euconostoc mesenteroi?des。根據(jù)16S rDNA序列分析，分離的44株菌均與模式菌株的同源性達(dá)到99%以上。

2.2.3 內(nèi)蒙古不同地區(qū)綿羊奶油中乳酸菌的優(yōu)勢(shì)菌種分析

研究表明，12份綿羊奶油中共分離出44株乳酸菌，分別為3個(gè)屬，7個(gè)種或亞種。內(nèi)蒙古不同地區(qū)綿羊奶油中乳酸菌的分離結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出，分離的44株乳酸菌中Lactococcus lactis subsp.lactis數(shù)量最多，12份樣品中8份樣品均有乳酸亞種，共分離15株，占總分離株的34%，為三個(gè)地區(qū)綿羊奶油中的優(yōu)勢(shì)菌種。12份樣品中4份樣品分離到了Lactobacillus helveticus，共分離13株，占總分離株的29%，為三個(gè)地區(qū)次優(yōu)勢(shì)菌種。其中鄂爾多斯地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌種為L(zhǎng)actobacillus helveticus，包頭、巴彥淖爾地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌種為L(zhǎng)actococcus lactis subsp.lactis。許多研究表明，不同地區(qū)和種類傳統(tǒng)乳制品中的乳酸菌組成存在一定的差異。Mourad等[19]人對(duì)采集自阿爾及利亞撒哈拉地區(qū)的20份傳統(tǒng)奶油中乳酸菌進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，Lactobacillus plantarum為優(yōu)勢(shì)菌種。杜曉華等[20]人對(duì)采集于蒙古國(guó)牧民家庭的17份發(fā)酵乳樣品中乳桿菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus ermentum為樣品中優(yōu)勢(shì)菌群。由此可見(jiàn)不同地區(qū)、不同地理環(huán)境優(yōu)勢(shì)菌種不同，即使同一地區(qū)采樣時(shí)間、貯藏時(shí)間等不同，結(jié)果也會(huì)有差異。

表4 內(nèi)蒙古不同地區(qū)綿羊奶油中乳酸菌的分離結(jié)果

2.3樣品中優(yōu)勢(shì)菌群定量分析

提取綿羊奶油樣品中的宏基因組DNA，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品中宏基因組DNA的濃度和純度，結(jié)果顯示，所有分離株的基因組DNA的濃度均在于100～2000 ng/μL之間，純度值（A260/A280比值）在1.8～2.0范圍內(nèi)。分離株基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，大約在23 Kb處有清晰、明亮的條帶，且無(wú)拖尾和彌散現(xiàn)象，由此可知樣品中宏基因組DNA滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。將膠回收后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，作為模板對(duì)相對(duì)應(yīng)的標(biāo)菌進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，結(jié)果表明3種標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）均達(dá)到0.99以上，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。包頭地區(qū)綿羊奶油中Lac.lac?tis.subsp.lactis、Leu.mesenteroides、L.plantarum的基因拷貝數(shù)，如圖3所示。

圖3 綿羊奶油樣品中優(yōu)勢(shì)菌種群的定量結(jié)果比較

由圖3可以看出，Lac.lactis subsp.lactis的基因拷貝數(shù)在包頭市奶油中平均達(dá)到(8.31±0.10)×108copies/ mL，Leu.mesenteroides的基因拷貝數(shù)在包頭市奶油中平均達(dá)到(3.94±0.25)×103copies/mL，L.plantarum的基因拷貝數(shù)在包頭市奶油中平均達(dá)到(5.78±0.27)×105cop? ies/mL，3種優(yōu)勢(shì)菌屬的數(shù)量關(guān)系為L(zhǎng)ac.Lactis.subsp. Lactis＞L.plantarum＞Leu.Mesenteroides，且3個(gè)樣品均符合這一數(shù)量關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究對(duì)內(nèi)蒙古不同地區(qū)的12份自然發(fā)酵綿羊奶油中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定和定量研究，樣品中活菌數(shù)平均為(8.38±0.09)mL-1（對(duì)數(shù)值）。共分離出44株菌，通過(guò)16S rDNA基因同源性分析，將44株鑒定為3個(gè)屬，7個(gè)種或亞種。其中Lactococcus lactis subsp. Lactis為三個(gè)地區(qū)綿羊奶油中的優(yōu)勢(shì)菌種，占總分離株的34%。同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR）技術(shù)對(duì)包頭地區(qū)樣品中優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明包頭地區(qū)綿羊奶油中，3種優(yōu)勢(shì)菌屬的數(shù)量關(guān)系 為 Lac.Lactis.subsp.Lactis＞L.plantarum＞Leu.Mesen?teroides。

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Isolation and identification of Lactic acid bacteria from naturally fermented sheep cream in Inner Mongolia as well as quantification of predominant species by q-PCR

LIU Hong-xin，DE Liang-liang，CHEN Hong-xia，LIU Wen-jun，SUN Tian-song
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural Universi?ty,Hohhot 010018,China)

In this study,Lactic acid bacteria(LAB)were isolated and purified by traditional pure culture method from 12 samples of naturally fermented sheep cream collected in Inner Mongolia,and then identified by 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis method.Mean?while,quantitive real-time quantity PCR(q-PCR)was applied to compare and quantitatively analyze the predominant species in traditional dairy products in Baotou,The results showed that the content of three predominant species was in the order of Lac.Lactis.subsp.lactis＞L. plantarum＞Leu.mesenteroides.in these sheep cream samples.

Lactic acid bacteria；isolation and identification；q-PCR；naturally fermented cream

Q939.11+7

A

1001-2230（2016）09-0016-04

2016-04-30

劉紅新（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锷砼c發(fā)酵工藝工程。

孫天松