狼瘡性腎炎患兒血管損傷中心肌素與miR-145的表達情況及其臨床意義研究

寧春艷，黨西強，宋 芳，易著文，何小解

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·論著·

狼瘡性腎炎患兒血管損傷中心肌素與miR-145的表達情況及其臨床意義研究

寧春艷，黨西強，宋 芳，易著文，何小解

目的 觀察狼瘡性腎炎(LN)患兒血管損傷中心肌素與miR-145的表達情況，并探討二者在LN患兒血管損傷發生中的作用。方法 選取2008年1月—2015年9月在湘雅二醫院兒科住院的系統性紅斑狼瘡(SLE)患兒中確診為LN的患兒49例，均行腎活檢，活檢組織常規進行免疫熒光、光鏡及電鏡檢查。依據國際腎臟病協會(ISN)和腎臟病理學會(RPS)2002—2003年聯合修訂的ISN/RPS 2003 LN分型標準進行病理分型，共分為Ⅱ型5例、Ⅲ型7例、Ⅲ+Ⅴ型9例、Ⅳ型17例、Ⅳ+Ⅴ型11例。以中膜比例評價血管損害程度，并分為輕度14例、中度19例、重度16例。依據KATAFUCHI等的評價方法對腎小球、腎間質損害進行半定量積分；采用雙抗體夾心法測定血清心肌素水平；采用原位雜交法檢測miR-145表達。結果 不同病理分型患兒腎小球、腎間質損害積分間差異均有統計學意義(P<0.05)。腎小球損害積分與腎間質損害積分呈直線正相關(r=0.961，P<0.01)。不同血管損害程度、病理分型患兒血清心肌素水平間差異均有統計學意義(P<0.05)。不同血管損害程度、病理分型患兒腎內血管miR-145表達間差異均有統計學意義(P<0.05)。血清心肌素水平與腎內血管miR-145表達呈直線正相關(r=0.782，P<0.01)；血清心肌素水平、腎內血管miR-145表達與血管損害程度呈直線負相關(r值分別為-0.728、-0.790，P<0.01)。結論 隨著血管損害程度的增加血清心肌素水平和腎內血管miR-145表達均降低，二者不僅可用于評估LN患兒腎內血管損害(RVLs)程度，也可能是LN腎血管損傷治療的新靶點。

兒童；狼瘡腎炎；血管損傷；心肌素；miR-145

寧春艷，黨西強，宋芳，等.狼瘡性腎炎患兒血管損傷中心肌素與miR-145的表達情況及其臨床意義研究[J].中國全科醫學，2016，19(31)：3831-3836.[www.chinagp.net]

NING C Y,DANG X Q,SONG F,et al.Expression of miR-145 and myocardin in vascular injuries of children with lupus nephritis and their clinical significance[J].Chinese General Practice，2016，19(31)：3831-3836.

本課題組前期在狼瘡性腎炎(Lupus Nephritis,LN)兒童腎組織中發現，腎內血管中膜明顯增厚，提示LN腎內存在血管平滑肌細胞 (vascular smooth muscle cells,VSMCs)過度增殖，但其增殖的機制尚未明確[1]。研究表明，心肌素與心血管疾病的發生發展關系非常密切，VSMCs過度表達心肌素后，可明顯激活VSMCs分化標志基因SM22α、SMα-MHC 、SMα-actin 等的表達，相反，抑制心肌素表達，可明顯降低SM22α表達[2]；WEI等[3]研究發現，動脈粥樣硬化時，miR-145表達下調；LOVREN等[4]對動脈粥樣硬化小鼠應用慢病毒包裝的miR-145治療后，結果顯示粥樣硬化明顯減輕、主動脈心肌素表達明顯增高，提示心肌素可以促進上調miR-145表達，參與血管損傷與修復。那么在LN患兒血管損傷過程中，心肌素與miR-145的相互關系如何？目前罕見報道。為此，本研究以LN患兒為研究對象，系統觀察LN患兒血管損傷過程中心肌素與miR-145的表達情況，探討二者在LN患兒血管損傷發生中的作用，為LN血管損傷治療提供新的靶點和理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2008年1月—2015年9月在湘雅二醫院兒科住院的系統性紅斑狼瘡(SLE)患兒中確診為LN的患兒49例，其中男11例，女38例；年齡3～16歲，平均年齡(8.4±2.1)歲。納入標準：均符合SLE的診斷標準，且符合以下 3 項中的 1 項：(1)1 周內3次尿蛋白陽性或24 h尿蛋白>0.15 g/d或尿常規中可見異常管型(紅細胞、白細胞、顆粒或混合管型)；

本文要點：

(1)狼瘡性腎炎(LN)是指系統性紅斑狼瘡(SLE)合并雙腎不同病理類型的免疫性損害，同時伴有明顯腎臟損害臨床表現的一種疾病；(2)LN患兒腎內血管損害(RVLs)主要表現為血管內膜脫落，中膜增厚；且中膜增厚程度愈高，內膜脫落程度與血管完整性缺失愈重；(3)隨著血管損害程度的增加血清心肌素水平和腎內血管miR-145表達均降低，二者不僅可用于評估LN患兒RVLs程度，也可能是LN腎血管損傷治療的新靶點。

(2)腎功能受累，即內生肌酐清除率<80 ml/min；(3)經腎活檢證實[5]。排除標準：感染、腫瘤及其他結締組織疾病。本研究經醫院倫理委員會批準，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 病理分型 所有患兒均行腎活檢，活檢組織常規進行免疫熒光、光鏡及電鏡檢查。同時依據國際腎臟病協會(ISN)和腎臟病理學會(RPS)2002—2003年聯合修訂的ISN/RPS 2003 LN分型標準進行病理分型[6]，共分為Ⅱ型5例、Ⅲ型7例、Ⅲ+Ⅴ型9例、Ⅳ型17例、Ⅳ+Ⅴ型11例。

1.2.1.1 腎臟病理損害評價 依據KATAFUCHI等[7]的評價方法對腎小球、腎間質損害進行半定量積分，選取每個患兒活檢HE染色切片1張觀察20個皮質區視野(×200)，根據腎小球內細胞增殖程度、腎小球局灶損害程度及球性硬化程度對腎小球損害程度進行評分。其中腎小球內細胞增殖程度評分：基本無細胞增殖1分、增殖<25% 2分、增殖25%～50% 3分、增殖>50% 4分；腎小球局灶損害程度評分：基本無局灶損害0分、損害<10% 1分、損害10%～25% 2分、損害26%～50% 3分、損害>50% 4分；球性硬化程度評分：基本正常0分、硬化<25% 1分、硬化26%～50% 2分、硬化51%～75% 3分、硬化>75% 4分。根據腎間質纖維化程度、炎性細胞浸潤程度、腎小管擴張/萎縮程度對腎間質損害程度進行評分：基本正常0分、病變<10% 1分、病變10%～24% 2分、病變25%～50% 3分、病變51%～75% 4分、病變>75% 5分。綜合20個視野評分得到各切片綜合評分。

1.2.2 實驗室檢查 患兒均進行血常規、凝血功能、肝功能(清蛋白、球蛋白)、血脂全套、腎功能(尿素氮、肌酐、尿酸)、尿沉渣、24 h尿蛋白定量等常規檢查。采用雙抗體夾心法測定血清心肌素水平，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.3 miR-145原位雜交及表達量檢測 探針序列為CTGGGAAAACTGGACCGTGAGG，購自長沙艾佳生物科技有限公司。腎活檢組織石蠟切片、厚度2～3 μm，脫蠟后置入3%過氧化氫(H2O2)室溫10 min，3%枸櫞酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37 ℃消化30 min，然后滴加預雜交液，37 ℃預雜交2 h后，加入稀釋好的雜交探針混合液(1∶500)，37 ℃雜交過夜。洗滌干燥后滴加封閉液，37 ℃ 30 min，直接滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃ 60 min，加鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)37 ℃下30 min，洗滌干燥后,滴加生物素化過氧化物酶37 ℃ 30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封固。200倍及400倍視野下觀察miR-145表達特點并拍照。使用醫學圖像分析系統測量miR-145陽性面積及陽性區域的平均灰度。

2 結果

2.1 49例LN患兒病理分型及其臨床特征 49例LN患兒中，Ⅱ型占10.2%，Ⅲ型占14.3%，Ⅲ+Ⅴ型占18.4%，Ⅳ型占34.7%，Ⅳ+Ⅴ型占22.5%，各病理分型的臨床特征見表1。

2.2 不同病理分型患兒腎小球、腎間質損害積分比較 不同病理分型患兒腎小球、腎間質損害積分間差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。腎小球損害積分與腎間質損害積分呈直線正相關(r=0.961，P<0.01)。

表1 49例LN患兒病理分型及其臨床特征(例)Table 1 Pathological types and clinical features of 49 children with LN

表2 不同病理分型患兒腎小球、腎間質損害積分比較，分)Table 2 Comparison of glomerular damage and renal interstitial injury scores of children with different pathological types

2.3 不同血管損害程度患兒血管測量指標比較 49例LN患兒平均血管損害程度為(0.65±0.11)，主要表現為血管內膜脫落，中膜增厚。中膜增厚程度愈高，內膜脫落程度與血管完整性缺失愈重，且血管中膜增厚嚴重程度與血管損害嚴重程度一致，其中尤以Ⅳ型及Ⅳ+Ⅴ型明顯。Ⅱ型LN患兒腎內血管內膜較完整，血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)增生明顯；Ⅲ型及Ⅲ+Ⅴ型部分內膜出現破壞，但可見部分內膜不對稱增生、中膜增厚輕重不一；Ⅳ型及Ⅳ+Ⅴ型內膜破壞嚴重，管腔可見脫落的VECs并嚴重狹窄，中膜增生明顯，VSMCs多數表現為紡錘形(見圖1)。5例Ⅱ型患兒中，4例血管損害程度為輕度、1例為中度，Ⅲ型及Ⅲ+Ⅴ型患兒血管損害程度均為中度，Ⅳ型及Ⅳ+Ⅴ型患兒內膜脫落明顯，血管損害程度為重度。不同腎小球損害程度患兒管壁厚度/血管外徑、內膜厚度/血管外徑、中膜厚度/血管外徑間差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。管壁厚度/血管外徑與腎小球、腎間質損害積分均呈直線正相關(r值分別為0.721、0.658，P<0.01)。

表3 不同血管損害程度患兒血管測量指標比較Table 3 Comparison of blood vessel measurement indexes of children with different degrees of vascular injury

2.4 不同血管損害程度、病理分型患兒血清心肌素水平比較 不同血管損害程度患兒血清心肌素水平間差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。不同病理分型患兒血清心肌素水平間差異亦有統計學意義(P<0.05，見表5)。

2.5 不同血管損害程度、病理分型患兒miR-145表達比較 根據不同的腎臟病理分型，取形態一致的腎內血管，比較其miR-145表達差異。miR-145主要表達于血管和腎小管，腎小管中主要表達于近曲小管的上皮細胞，腎內血管主要表達于VSMCs，血管管徑越大，miR-145表達相對越多(見圖2)。不同血管損害程度患兒腎內血管miR-145表達間差異有統計學意義(P<0.05，見表6)。不同病理分型患兒腎內血管miR-145表達間差異亦有統計學意義(P<0.05，見表7)。血清心肌素水平與腎內血管miR-145表達呈直線正相關(r=0.782，P<0.01)；血清心肌素水平、腎內血管miR-145表達與血管損害程度呈直線負相關(r值分別為-0.728、-0.790，P<0.01)。

表4 不同血管損害程度患兒血清心肌素水平比較Table 4 Comparison of serum myocardial level among children with different degrees of vascular injury

表5 不同病理分型患兒血清心肌素水平比較Table 5 Comparison of serum myocardin level among children with different pathological types

注：A為Ⅱ型，B為Ⅲ型，C為Ⅲ+Ⅴ型，D為Ⅳ型，E為Ⅳ+Ⅴ型；PAS染色=過碘酸-雪夫染色

圖1 不同病理分型患兒血管損害情況(PAS染色，×400)

Figure 1 Vascular injury of children with different pathological types

注：A為大管徑血管(HE染色×200)；B為中等管徑血管(HE染色×400)；C為小管徑血管(HE染色×400)

圖2 不同管徑腎內血管miR-145表達情況

Figure 2 miR-145 expression in renal vessels of different pipe diameters

表6 不同血管損害程度患兒腎內血管miR-145表達比較Table 6 Comparison of miR-145 expression in renal vessels of children with different degrees of vascular injuries

表7 不同病理分型患兒腎內血管miR-145表達比較Table 7 Comparison of miR-145 expression in renal vessels of children with different pathological types

3 討論

SLE患者是心血管疾病，尤其是動脈粥樣硬化的高危人群[9]，其冠狀動脈病變的發生率是普通人群的數倍[10-11]。事實上，當患者診斷SLE不久，即出現輕重不等的大、小血管的功能障礙和損害[12]。SLE患者中有45%～85%臨床表現為LN及腎內血管損害(RVLs)[13-14]。RVLs可進一步促進、加重慢性LN進展，形成惡性循環。因此，充分了解LN患者RVLs病變情況及可能的發生機制，具有極其重要的臨床意義。

本研究中49例SLE住院患兒腎活檢均發現輕重不一的腎臟損害，其中Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型共28例(57.1%)，說明兒童LN病理損害較重，這可能也是兒童LN較成人臨床表現更嚴重、預后更差的原因之一；本研究中LN患兒腎小球損害評分與其病理分型保持一致，與目前多以腎小球受損的描述診斷作為主要分型依據相符合；49例LN患兒均存在不同程度的血管內膜脫落或中膜增厚，且隨著中膜增厚程度越重，血管內膜脫落程度也愈重，血管完整性缺失也隨之加重，由此可見，血管中膜增厚程度在一定程度上可用于評價RVLs病變程度。因此，若在目前LN病理診斷中應加入腎間質血管損害評估，將對LN患兒病情及治療指導更具意義。

血管損傷后主要有2個修復過程：內皮再生修復內膜和平滑肌增殖遷移形成新生內膜，修復的最終效果主要取決于這2 種修復方式之間的動態平衡。正常情況下，血管壁中膜的VSMCs呈分化表型，也稱收縮表型，表達SMα-actin、SM-MHC和SM22α等平滑肌特異的收縮蛋白；當血管受到損傷因素刺激時，VSMCs可從收縮表型轉化為合成表型并獲得增殖能力，同時VSMCs特異收縮蛋白的表達被抑制。血管生理的多項研究表明VSMCs可以很大限度地在合成表型和收縮表型間轉換，在VSMCs過度表達心肌素后,可明顯激活VSMCs分化標志基因如SM22α、SMα-MHC 和SMα-actin 等的表達[3]，相反，過度表達心肌素顯性負性突變體或心肌素siRNA后,可明顯降低SM22α表達，表明心肌素是調節此種轉換的關鍵蛋白[15]。本研究結果顯示，血管中、重度損害患兒外周血心肌素水平明顯低于血管輕度損害患兒；Ⅱ型患兒外周血心肌素水平最高，Ⅲ、Ⅲ+Ⅴ、Ⅳ、 Ⅳ+Ⅴ型患兒外周血心肌素水平依次降低，說明LN患兒外周血心肌素水平越低，RVLs則越重，進而提示檢測LN患兒外周血心肌素水平可能是一種評估其RVLs程度的新指標。

2009年，CORDES等[16]發現miR-145在鼠胚胎向VSMCs分化的過程中必不可少，同時證實心肌素可以激活miR-145的表達，而miR-145的3′URT可直接結合心肌素而促進VSMCs分化，提示心肌素可通過上調miR-145表達，參與血管損傷與修復。WEI等[3]研究發現miR-145在動脈粥樣硬化表達下調；LOVREN等[4]研究發現應用miR-145可通過上調主動脈心肌素表達明顯減輕粥樣硬化，這啟示若能為VSMCs提供充足的miR-145基因，將能減緩甚至逆轉血管性疾病。以上研究發現，血管損害越重，血管平滑肌中miR-145基因表達越低，本研究相關分析發現，血清心肌素水平與血管中miR-145表達呈直線正相關，血清心肌素水平、血管中miR-145表達與血管損害程度則呈直線負相關，說明miR-145基因也可能是LN腎血管損傷的標志物及血管損害治療的一個新靶點。但miR-145基因表達下調是否由心肌素下降所致？還需進一步研究。

綜上所述，LN患兒存在不同程度的RVLs，血清心肌素水平與腎內血管miR-145表達與血管損害程度呈直線負相關，LN患兒血清心肌素水平與腎內血管miR-145表達不僅可用于評估LN患兒RVLs程度，也可能是LN腎血管損傷治療的新靶點。但miR-145與心肌素相互作用在LN血管損害發生與發展中的機制尚有待于進一步研究。

作者貢獻：寧春艷負責病理統計分析、心肌素檢測；黨西強、宋芳負責臨床病例收集；易著文負責技術指導；何小解為項目負責人，負責論文設計與寫作。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔沙沙)

Expression of miR-145 and Myocardin in Vascular Injuries of Children with Lupus Nephritis and Their Clinical Significance

NINGChun-yan,DANGXi-qiang,SONGFang,YIZhu-wen,HEXiao-jie.

LaboratoryofPediatricNephropathy,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity;DepartmentofPediatrics,theThirdHospitalofChangsha,Changsha410011,China

HEXiao-jie,LaboratoryofPediatricNephropathy,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China;E-mail:hexj7150@163.com

Objective To examine the expression of miR145 and myocardin in vascular injuries of children with lupus nephritis(LN),and to discuss their roles in the development of vascular injuries of LN children.Methods 49 systemic lupus erythematosus(SLE) inpatients who were diagnosed with LN in the Department of Pediatrics in the Second Xiangya Hospital from January 2008 to September 2015 were enrolled in this study.All patients underwent renal biopsy.Immunofluorescence,light microscopic and electron microscopic examination were given to biopsy tissues routinely.According to 2002—2003 typing criteria of LN that jointly revised by International Society of Nephrology(ISN)/Renal Pathology Society(RPS),pathological typing was conducted,and there were 5 cases in type Ⅱ,7 in type Ⅲ,9 in type Ⅲ+Ⅴ,17 in type Ⅳ and 11 in type Ⅳ+Ⅴ.The degree of vascular injury was evaluated by the proportion of tunica media,and the subjects were divided into 14 mild cases,19 moderate cases,and 16 severe cases.According to KATAFUCHI and other methods of evaluation,semi-quantitative scores of glomerular damage and renal interstitial injury were made;the level of serum myocardin was measured by double antibody sandwich method;and the expression of miR-145 was detected by in situ hybridization method.Results There were significant differences in the scores of glomerular damage and renal interstitial injury among children of different pathological types(P<0.05).There was a positive linear correlation between the score of glomerular damage and the score of renal interstitial injury(r=0.961,P<0.01).The level of serum myocardin was significantly different between children with different vascular injury degrees and pathological types(P<0.05).The expression of miR-145 in renal blood vessels was significantly different between children with different vascular injury degrees and pathological types(P<0.05).There was a positive linear correlation between the level of serum myocardin and the expression of miR-145 in renal blood vessels(r=0.782,P<0.01);and the level of serum myocardin and the expression of miR-145 in renal blood vessels were negatively correlated with the degree of vascular injuries(values ofrwere -0.728,and -0.790 respectively;P<0.01).Conclusion With the increase of the degree of vascular injuries,the level of serum myocardin and the expression of miR-145 in renal blood vessels were both decreased,the two can not only be used to assess the degree of renal vascular lesions(RVLs) of children with LN,but also may be a new target for the treatment of renal vascular injury in LN.

Child;Lupus nephritis;Vascular injury;Myocardin;miR-145

國家自然科學基金資助項目(30500546)

410011湖南省長沙市，中南大學湘雅二醫院兒童腎臟病研究室(寧春艷，黨西強，易著文，何小解)；長沙市第三醫院兒科(寧春艷，宋芳)

何小解，410011湖南省長沙市，中南大學湘雅二醫院兒童腎臟病研究室；E-mail：hexj7150@163.com

R 593.242

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.31.015

2016-05-07；

2016-09-22)