動物尿液中鹽酸克侖特羅殘留檢測LC—MS/MS法探討

摘 要：本文在參考國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬尿中鹽酸克侖特羅殘留進(jìn)行了探討，建立了快速測定動物尿液中鹽酸克侖特羅的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法。用移液槍準(zhǔn)確吸取1.00 mL樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈水，渦旋混合后超聲。取樣液過固相萃取小柱，用玻璃小管收集，移出至黑色帶刻度離心管，再用45 ℃水浴氮吹至吹干。最后用1.00 mL流動相溶解定容，充分渦旋混合，過膜后上UPLC-MS/MS測定，建立了豬尿中鹽酸克侖特羅殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 86；加標(biāo)回收試驗的變異系數(shù)及回收率范圍等結(jié)果滿足GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求。本試驗方法前處理過程簡便、快捷、易操作，LC-MS/MS及流動相梯度等一系列的條件設(shè)置合理，經(jīng)LC-MS/MS打碎后的定性定量離子辨識度高，有較高的響應(yīng)，測得檢出限可滿足檢測需求，驗證結(jié)果具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，可用于豬尿中鹽酸克侖特羅殘留檢測[1]。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；豬尿；鹽酸克侖特羅；檢測方法

中圖分類號：Q859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-0769（2017）06-0083-03

克侖特羅，英文名Clenbuterol，俗稱瘦肉精，分子式為：C12H18Cl2N2O·HCl，分子量為313.7。它屬于擬腎上腺素類藥物，臨床上用于治療人的支氣管哮喘[2]。上世紀(jì)末，國外一家公司發(fā)現(xiàn)，鹽酸克侖特羅可促進(jìn)動物生長，并增加畜禽產(chǎn)品的瘦肉率，改善胴體品質(zhì)，這一新發(fā)現(xiàn)被用于養(yǎng)殖業(yè)。但是，動物食用后，會在內(nèi)臟和組織中形成大量殘留，人食用了含有克侖特羅的畜禽產(chǎn)品會出現(xiàn)中毒癥狀[3]。鹽酸克侖特羅屬于中度蓄積性藥物，在動物組織內(nèi)的蓄積與其劑量和給藥持續(xù)時間有關(guān)，其殘留量隨停藥期的延長逐漸下降[4]。有研究表明：克侖特羅在動物體內(nèi)殘留主要集中在肺、肝、腎及肌肉等組織中。克倫特羅在肺、肝臟中的殘留普遍高于腎臟，且殘留時間會比較久[5]。克倫特羅大量以原型藥物形式經(jīng)尿液排出，尿中濃度比血液中的濃度高40倍 [6]。

動物源性食品中的獸藥殘留越來越受到人們的重視，瘦肉精殘留早已成為人們普遍關(guān)注的社會問題，一些國家禁止在飼料中使用瘦肉精。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第193號公告，規(guī)定在所有食品動物中禁止使用克侖特羅。國內(nèi)有關(guān)部門也加強(qiáng)檢測和管理，開展對飼料中獸藥殘留的檢測是從源頭上控制的非常有效手段[7]。而本試驗方法就是希望能對動物尿樣用簡單的操作、簡化的前處理后來經(jīng)過LC-MS/MS的快速檢測，且大容量的檢測，還能測得具有較好的精密度和準(zhǔn)確度的結(jié)果[8]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備與試劑

1.1.1 主要儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（4500質(zhì)譜ExionLC），移液槍，離心機(jī)（Sigma公司，轉(zhuǎn)數(shù)大于7 000 r/min），渦旋振蕩器，氮吹儀，固相萃取儀，固相萃取小柱（HLB PRIME 6 cc），離心管，濾膜（津騰：0.22 μm，水系）。

1.1.2 主要試劑

鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），甲酸，二次蒸餾水等。

1.2 試驗方法

取待測尿樣放置于室溫，若樣品渾濁，可離心或者過濾。用移液槍準(zhǔn)確吸取1.00 mL尿樣于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈水（80%乙腈水+0.2%甲酸+20%水），渦旋混合1 min，混合后超聲5 min。取7 mL樣液過固相萃取小柱（PRIME 6 cc），保持1 s/滴的速度，用15 mL玻璃小管收集，移出5.5 mL至15 mL黑色帶刻度離心管，再用45 ℃水浴氮吹儀氮氣吹干。最后用1.00 mL流動相（甲酸水：甲酸0.09+水90+甲醇10）溶解定容，充分渦旋混合，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)測定[9]。

1.3 上機(jī)測定

液相色譜及質(zhì)譜條件：

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm， 3.0 mm×100 mm）；

柱溫：40 ℃；

流動相：A（0.1%甲酸水），B（甲醇%）；流動相梯度條件見表1。

流速：0.300 mL/min；

進(jìn)樣量：5.0 μL；

離子源：電噴霧離子源；

掃描方式：正離子掃描；

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；

離子源電壓：5 500 V；

輔助氣溫度：500 ℃；

母離子、子離子、采集時間、去簇電壓、碰撞能量及出口電壓，見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性試驗

按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，在空白樣品中添加一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.0 μg/L、4.0 μg/L、10.0 μg/L、30.0 μg/L和100.0 μg/L）（上機(jī)濃度），按照方法進(jìn)行前處理后，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)行上機(jī)測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)r=0.999 86。

4.2 方法精密度和回收率實驗

以空白豬尿樣品為基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)濃度分別為2.0 μg/kg、10.0 μg/kg和30.0 μg/kg。將加標(biāo)樣品和空白樣品按方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測試，結(jié)果見表3、表4和表5。

5 結(jié)論

經(jīng)過上述實驗驗證，本方法用于豬尿中鹽酸克侖特羅殘留的測定，一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、30.0 μg/L、100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r=0.999 86；2.0 μg/kg、10.0 μg/kg、30.0 μg/kg加標(biāo)試驗變異系數(shù)分別為3.49%、2.31%、4.86%，加標(biāo)試驗回收率范圍分別為88.50%～96.00%、87.20%～92.20%、85.47%～96.77%。方法驗證結(jié)果滿足GB/T 27404-2008的要求，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度；人員檢測能力滿足實際檢測工作的需要。

本試驗方法前處理過程簡便、快捷、易操作，LC-MS/MS及流動相梯度等一系列的條件設(shè)置合理，經(jīng)LC-MS/MS打碎后的定性定量離子辨識度高，有較高的響應(yīng)，測得檢出限可滿足檢測需求，驗證結(jié)果具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，可用于豬尿中鹽酸克侖特羅殘留檢測。□□

參考文獻(xiàn)：（9篇，略）