槐角丸微生物限度檢查方法驗證研究

摘要：目的 建立槐角丸的微生物限度檢查方法。方法 采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行計數(shù)方法驗證，采用直接接種法進(jìn)行控制菌檢查方法驗證。結(jié)果 可采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定，需采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)測定，可采用直接接種法進(jìn)行控制菌檢查。

關(guān)鍵詞：槐角丸；微生物限度檢查；方法驗證

槐角丸具有清腸疏風(fēng)，涼血止血的功效。用于血熱所致的腸風(fēng)便血，痔瘡腫痛。因其治療效果確切，患者對其普遍認(rèn)同，因而廣泛用于臨床。由于現(xiàn)行收載的檢查項下，沒有規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，為此對槐角丸按照《中國藥典2010年版一部》進(jìn)行微生物限度檢查方法驗證，從而有效地提高了微生物污染菌的檢出率，保證了檢查結(jié)果的有效性和可靠性。

1 儀器與材料

1.1儀器 MJ-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2試驗菌 枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]。

1.3試驗試材 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、氯化鈉蛋白胨緩沖液，以上培養(yǎng)基均由北京陸橋技術(shù)有限公司提供。

稀釋液：①0.9%無菌氯化鈉溶液（用于菌液稀釋）；②pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（用于供試品制備）。

1.4供試品 槐角丸批號150501，藥品批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字Z61021362，由陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1菌液的制備 按照《中國藥典2010年版一部》附錄要求，采用10倍稀釋法將5種陽性菌分別稀釋至50～100cfu/ml的菌懸液，備用。

2.2供試液的制備 取供試品10g，加入到100ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖使充分溶解，離心（500r/min，3min），取上清液作為1：10供試液，備用。

2.3方法驗證

2.3.1計數(shù)方法驗證

2.3.1.1常規(guī)法 取供試液1ml和已制備好的5種陽性菌液分別1ml加入到培養(yǎng)皿中，加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)皿傾注15～20ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，35℃培養(yǎng)3d，加入白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)皿傾注15～20ml玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，25℃培養(yǎng)5d，作為試驗組，同法測定所加的試驗菌作為菌液組，測定供試品的本底菌作為供試品對照組，進(jìn)行3次獨立試驗。采用平皿計數(shù)法，計算回收率：試驗組菌回收率（%）=[（試驗組菌數(shù)-供試品對照組菌數(shù)）/菌液組菌數(shù)]×100%，結(jié)果見表1。

結(jié)果白色念珠菌、黑曲霉的回收率>70%，表明霉菌和酵母菌可采用常規(guī)法進(jìn)行檢查，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率<70%，表明供試品對這兩種細(xì)菌有一定程度的抑菌性，需采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行進(jìn)一步的方法驗證。

2.3.1.2 培養(yǎng)基稀釋法 分別取供試液（0.5ml/皿）和（0.2ml/皿），再分別加入試驗菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌各50～100cfu/皿，同常規(guī)法進(jìn)行試驗，測定回收率。見表2。

由表2結(jié)果看，采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿），兩種陽性菌的回收率仍小于70%，而采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）兩種陽性菌的回收率均大于70%，表明可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）對本供試品進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)測定。

2.3.2控制菌方法驗證 直接接種法。

2.3.2.1大腸埃希菌 參照《中國藥典2010年版一部》附錄控制菌檢查大腸埃希菌檢查項下的方法進(jìn)行試驗，見表3。

2.3.2.2大腸菌群 參照《中國藥典2010年版一部》附錄控制菌檢查大腸菌群檢查項下的方法進(jìn)行試驗，見表4。

表3、表4試驗結(jié)果表明，試驗組和陽性對照組均分別檢出大腸埃希菌和大腸菌群；陰性對照組均未檢出試驗菌。可采用直接接種法進(jìn)行控制菌中大腸埃希菌和大腸菌群的檢查。

3 討論

本實驗對槐角丸的微生物限度檢查方法按照《中國藥典2010年版一部》進(jìn)行方法驗證，結(jié)果可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)檢查，可采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌計數(shù)，可采用直接接種法進(jìn)行控制菌的檢查。

本試驗研究結(jié)果表明，槐角丸對細(xì)菌中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有較強的的抑制作用，不能采用常規(guī)法直接對槐角丸進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)測定。槐角丸全方由槐角、地榆炭、黃芩、枳殼、當(dāng)歸、防風(fēng)組成。由于槐角丸組成較為復(fù)雜，一些組成成分本身對微生物有不同程度的抑制作用[2]，具體哪種中藥成分或者幾種中藥成分的共同抑菌作用還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79-86.

[2]路俊仙，崔璐，等.不同種質(zhì)黃芩體外抑菌作用的研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2009（06）.編輯/周蕓霏