酶聯(lián)免疫測(cè)定中出現(xiàn)非特異性反應(yīng)的原因及探討

摘要：目的 對(duì)醫(yī)學(xué)酶聯(lián)免疫測(cè)定中所出現(xiàn)的非特異性反應(yīng)原因進(jìn)行分析和探討，并對(duì)其應(yīng)對(duì)措施進(jìn)行了總結(jié)和討論。方法 選取2014年1月～2015年1月這一時(shí)間段內(nèi)所應(yīng)用的酶聯(lián)免疫測(cè)定為研究對(duì)象，并對(duì)其所出現(xiàn)的非特異性反應(yīng)進(jìn)行了調(diào)查和原因分析。結(jié)果 在所調(diào)查的20000例酶聯(lián)免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，其中出現(xiàn)非特異性反應(yīng)的有7340例，非特異性反應(yīng)發(fā)生率為36.7%；結(jié)論 由于各種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)之所以會(huì)出現(xiàn)一系列的非特異性反應(yīng)，原因就在于所應(yīng)用的試劑盒在質(zhì)量方面有著一定的區(qū)別、被測(cè)物體中的各項(xiàng)因素，如外源性因素和內(nèi)源性因素，兩大影響因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有著重要的意義；應(yīng)對(duì)措施：加強(qiáng)檢驗(yàn)工作人員的專業(yè)技能及業(yè)務(wù)操作能力、責(zé)任意識(shí)也就顯得尤為重要，在檢測(cè)過(guò)程中盡量的減少在加樣、洗板、結(jié)果判斷等過(guò)程中的人為誤操作而造成的誤差，從而有效確保將酶聯(lián)免疫測(cè)定中的非特異性反應(yīng)的影響降到最低，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，同時(shí)也確保了血液質(zhì)量的安全。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫；非特異性反應(yīng)；原因分析；探討

Abstract：Objective The reasons of nonspecific reaction in the enzyme immunoassay were analyzed and discussed， and the countermeasures were summarized and discussed.Methods The enzyme linked immunosorbent assay was used in the period of ～2015 in January， January 2014， and the non-specific reaction was investigated and analyzed.Results In the 20000 cases of enzyme linked immunosorbent assay， there were 7340 cases of nonspecific reactions， and the incidence rate was 36.7%.Conclusion Due to the variety of enzyme linked immunosorbent assay has a nonspecific response to a series of， the reason lies in the kit which is applied to a certain difference， the factors measured in the object in terms of quality， such as exogenous and endogenous factors， plays an important role in the accuracy of two major influence factors on the experimental results countermeasures： strengthen inspection； staff awareness of professional skills and operation ability， responsibility is particularly important， the error in the detection process as much as possible to reduce human errors in the sample， washing plate， etc. in the process of judging the results caused by， so as to effectively ensure that will affect the nonspecific reaction enzyme-linked immunosorbent assay the lowest， in order to achieve the accuracy and reliability of test results， but also to ensure that the quality of blood safety..

Key words：Enzyme linked immunosorbent assay； Nonspecific reaction； Cause analysis； Studyc

自上世紀(jì)70年代酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)問(wèn)世以來(lái)，憑借其特異性強(qiáng)、使用安全以及較高的敏感性和簡(jiǎn)便的操作等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用到現(xiàn)代臨床醫(yī)療診斷過(guò)程中，并且作為了臨床的一種主要的免疫診斷方法，但由于技術(shù)上的欠缺不足，使得其在具體應(yīng)用實(shí)踐過(guò)程中也暴露出了一定的問(wèn)題，如非特異性問(wèn)題的出現(xiàn)，基于此，本文針對(duì)酶聯(lián)免疫測(cè)定中所出現(xiàn)的非特異性反應(yīng)的具體原因機(jī)制進(jìn)行了分析和討論。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本站2014年1月～2015年1月這段時(shí)間的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本20000人份，均符合國(guó)家規(guī)定的獻(xiàn)血者體格檢查標(biāo)準(zhǔn)，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)定，其中共有7340例出現(xiàn)了特異性反應(yīng)，發(fā)生率達(dá)36.7%。

1.2試劑與儀器 所用試劑盒是中國(guó)生物檢定所檢定合格的試劑；所用儀器由澳斯幫公司每年定期檢定的：STAR全自動(dòng)加樣儀和FAME全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)系統(tǒng)。

1.3方法 通過(guò)回顧性調(diào)查分析的方法，并對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和收集，同時(shí)與專業(yè)工作人員進(jìn)行及時(shí)溝通。

2 結(jié)果

在所調(diào)查的20000例酶聯(lián)免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，其中出現(xiàn)非特異性反應(yīng)的有7340例，非特異性反應(yīng)發(fā)生率為36.7%。

3 討論

3.1試劑盒特異性的影響因素及應(yīng)對(duì)方法分析

3.1.1固相載體的選擇 微孔板作為酶聯(lián)免疫測(cè)定中應(yīng)用最為廣泛的固相載體，這些載體（除了膜片外）在多數(shù)情況下所應(yīng)用的也都是聚苯乙烯，其中聚苯乙烯平地微孔板就是一種最為常見(jiàn)的固相載體，該載體具備了優(yōu)異的蛋白吸附能力，也兼具了良好的透光性，但同時(shí)需要指出的是，該載體對(duì)于蛋白的吸附現(xiàn)象屬于一種疏水性的物理吸附現(xiàn)象，該載體并能夠?qū)⒏黝悇e的蛋白同時(shí)吸附到其表面，所以，這也就導(dǎo)致了在酶聯(lián)免疫測(cè)定中的任何一個(gè)操作環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，對(duì)于出現(xiàn)的非特異性反應(yīng)在操作過(guò)程中也都是需要采取一定的加以防止的。

現(xiàn)階段，醫(yī)療領(lǐng)域微孔板的種類數(shù)目繁多，不同的類型都有著不同的性質(zhì)，因此，在酶聯(lián)免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行過(guò)程中，微孔板的選擇就顯得尤為重要。首先，對(duì)于一個(gè)全新的系統(tǒng)在進(jìn)行微孔板的選擇過(guò)程中，前期必要要進(jìn)行科學(xué)的評(píng)估和認(rèn)證，從而選擇出最佳的型號(hào)和類別；在微孔板的生產(chǎn)上架和具體型號(hào)確定之后，在真正使用之前還需要對(duì)微孔板進(jìn)行吸附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，在達(dá)到規(guī)定要求標(biāo)準(zhǔn)后方可投入使用。

3.1.2包被抗體同酶標(biāo)抗體的配伍以及相應(yīng)的抗體效價(jià) 在酶聯(lián)免疫測(cè)定過(guò)程中的所應(yīng)用的雙抗體夾心法，如果一旦出現(xiàn)了不合理的酶標(biāo)抗體與包被抗體的配伍現(xiàn)象，將會(huì)直接導(dǎo)致包被抗體與酶標(biāo)抗體同各種雜質(zhì)的相錯(cuò)認(rèn)，最終導(dǎo)致非特異性反應(yīng)的出現(xiàn)。對(duì)于測(cè)定試劑特異性的決定方面，抗體的效價(jià)發(fā)揮了極具重要的作用；相比較于低效價(jià)的抗體，高效價(jià)的抗體的特異性一般有著明顯的優(yōu)勢(shì)。因?yàn)閷?duì)于高效價(jià)的抗體，具有了較高的濃度，同時(shí)其稀釋度也是比較大的，在高效價(jià)的抗體中含有較少的雜質(zhì)，能夠有效地減少和降低非特異性吸附能力。因此，在試劑的開(kāi)發(fā)研制階段，對(duì)于單抗以及多抗的篩選工作必須要投入足夠的精力和時(shí)間。

3.1.3封閉操作 在酶聯(lián)免疫測(cè)定法中，封閉操作作為一項(xiàng)重要的步驟，其目的就是為了將在固相載體上所留下的空白暴露位點(diǎn)實(shí)施封閉，以達(dá)到有效減少后續(xù)操作中的非特異性蛋白的干擾，在操作過(guò)程中所應(yīng)用的封閉試劑一般也都是一些惰性物質(zhì)（如小牛血清、明膠和牛血清血白蛋白等）；在封閉操作之后，如果在微孔板中仍然存在著暴露位點(diǎn)，那么就會(huì)直接將在后續(xù)操作步驟中的非特異性蛋白直接吸附到微孔板上，實(shí)現(xiàn)與酶標(biāo)的相結(jié)合，因而產(chǎn)生非特異性反應(yīng)；另外，也可能是將酶標(biāo)抗體直接的吸附到微孔板上而而出現(xiàn)顯色反應(yīng)，所以如何選擇最為合適的封閉試劑就成為了一關(guān)鍵性步驟；一般情況下，封閉試劑的選擇都是結(jié)合著系統(tǒng)的具體特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行，從而確定所選試劑的科學(xué)性和合理性。在判斷所選試劑是否與系統(tǒng)相符時(shí)，功能性試驗(yàn)就成為了一主要的確定方法。

3.2檢測(cè)標(biāo)本中是否含有酶標(biāo)記物的干擾物

3.2.1內(nèi)源性干擾物 檢測(cè)標(biāo)本中的內(nèi)源性干擾物主要包括了類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體以及黃疽等；其中類風(fēng)濕性因子屬于一種能夠同時(shí)作用于人和動(dòng)物的抗體，其多為1GM類，并能夠充當(dāng)抗原成分與固相酶標(biāo)抗體進(jìn)行反應(yīng)，從而出現(xiàn)非特異性反應(yīng)；應(yīng)對(duì)措施就是制備一FAB段抗體，成功的將抗體與類風(fēng)濕因子之間的連接切斷。而在黃疽血標(biāo)本中通常都會(huì)含有一些內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶，當(dāng)選用辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記物時(shí)，非特異性反應(yīng)出現(xiàn)的可能性也就會(huì)極具增加；在人類的血清中存在著能夠與嚙齒類動(dòng)物相結(jié)合的天然型嗜異性抗體，當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)所應(yīng)用的是鼠源性單抗體時(shí)，嗜異性抗體就會(huì)很容易的與之結(jié)合，從而形成一種假陽(yáng)性，出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，具體應(yīng)對(duì)方法就是在所用的樣品稀釋液和酶標(biāo)稀釋液中添加適量的增長(zhǎng)鼠血清，從而能夠很好的中和嗜異性抗體。

3.2.2外源性干擾物 外源性干擾物主要包括了樣本的不合理采集、貯存以及處理等操作，比如細(xì)菌的污染、樣本的溶血、采血人員在給獻(xiàn)血員采集血液的過(guò)程中由于選擇血管不正確致血流不暢；采集完的血液在標(biāo)本留取過(guò)程中混勻不均致標(biāo)本抗凝不充分，纖維蛋白析出以及標(biāo)本處理時(shí)離心時(shí)間、離心力達(dá)不到等多項(xiàng)因素。

3.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具體問(wèn)題導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)

3.3.1洗滌 在酶聯(lián)免疫測(cè)定過(guò)程中，為實(shí)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果的可重復(fù)性，正確的洗滌作為了重要的第一步。對(duì)于洗滌過(guò)程不管是手工操作還是儀器操作，其所得結(jié)果的準(zhǔn)確性都與正確的洗滌操作有著緊密的聯(lián)系?，F(xiàn)階段比較常用的兩種洗滌方法主要有：其一，增加浸泡時(shí)間，減少洗滌次數(shù)；其二就是多次快速的洗滌過(guò)程，增加洗滌次數(shù)而減少侵泡時(shí)間；上述兩種洗滌方法均能得到令人滿意的效果。

3.3.2移液器的精度不夠 對(duì)于酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，測(cè)定標(biāo)本前期都是需要進(jìn)行一定的稀釋過(guò)程，這一過(guò)程中如果移液器的精度不夠，那么就很有可能出現(xiàn)誤差，特別是在稀釋數(shù)倍的操作中，即使是存在著很小的絕對(duì)誤差，那么也將會(huì)導(dǎo)致后期出現(xiàn)很大的相對(duì)誤差，從而引發(fā)非特異性反應(yīng)。所以為確保測(cè)定結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性，移液器的精度有著重要作用，因此，加大對(duì)移液器的保養(yǎng)工作就顯得尤為重要。目前，本站使用的是全自動(dòng)酶免儀處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差。

3.3.3操作不合理、失誤 對(duì)于過(guò)程中所應(yīng)用到的每一種試劑，都有一種最佳的反應(yīng)模式，為確保所得結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性，對(duì)相關(guān)試劑的操作就要嚴(yán)格按照相關(guān)說(shuō)明進(jìn)行，科學(xué)的控制溫度和溫育時(shí)間是執(zhí)行環(huán)節(jié)中重要內(nèi)容；如果孵育溫度過(guò)高或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，都將導(dǎo)致整板本出現(xiàn)過(guò)高的陽(yáng)性率及較高的本底，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)語(yǔ)

目前由于相關(guān)技術(shù)條件上的制約，使得酶聯(lián)免疫吸附法在技術(shù)上層面還無(wú)法達(dá)到一種標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)應(yīng)的在測(cè)定過(guò)程中也會(huì)不可避免的出現(xiàn)一定的非特異性反應(yīng)；經(jīng)過(guò)上述原因分析，我們了解到，對(duì)于各項(xiàng)原因下出現(xiàn)的特異性反應(yīng)需要采取一定的應(yīng)對(duì)措施，進(jìn)而能夠最大限度的將非特異性顯色反應(yīng)的影響降到最低，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性的有效提高。

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